PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因转录水平的变化

朱艳平，刘 佳,2，何 勇，岳 锋，李文明,2，郭东光，孟广超，王选年,2

（1.新乡学院 生命科学与基础医学学院 动物疫病分子诊断河南省工程实验室，河南 新乡 453003; 2.郑州大学 生命科学技术学院，河南 郑州 450000）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是目前危害世界养猪业的主要病毒之一，其致病力与毒株类型直接相关。PCV2分型的依据是ORF2的序列差异。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e 5个亚型，其中PCV2b是当前主要流行的基因型[1-2]。当前国内呈现不同基因亚型同时流行的新形势[1,3-4]，PCV2a和PCV2b混合感染增多，PCV2d感染也出现增加趋势，并且呈现出成为感染主要亚型的趋势[5]。为控制PCV2引起的相关疾病，减轻养猪业的重大经济损失，世界各地都广泛接种PCV2疫苗。因此，有必要研究新的疫苗或疫苗佐剂，用于PCV2的预防。

PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（open reading frame，ORF），其中ORF1和ORF2是PCV2复制和发病所需的主要结构和功能蛋白[6]。ORF1编码病毒DNA环状复制所必需的Rep和Rep’蛋白。PCV2的ORF2编码的Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白，也是主要免疫原性蛋白，包含若干个主要保护性抗原的线性B细胞表位及中和性抗原表位，常被研制成PCV2亚单位疫苗应用于生产[7]。各公司疫苗的免疫效果各不相同，其中，疫苗抗原和佐剂发挥了重要作用。目前，PCV2疫苗佐剂的研究主要集中在脂质体和细胞因子等方面[8-9]，其中，细胞因子佐剂是重点研究对象，包括白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）、IL-18、干扰素γ（Interferon γ，IFN-γ）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等。目前，IL-21作为疫苗佐剂的研究较少，但其具有正向调节机体免疫应答的功能，可用于疫苗佐剂的开发。

PCV2感染时，IL-17表达水平上升[6]，这是IL-6与其受体结合活化辅助性T细胞17（Th17细胞）的结果。Th17细胞主要分泌IL-17和IL-21，而IL-21能够增强B细胞分泌抗体的能力，还能促进Th17细胞分化，分泌IL-17和IL-21[10]。目前，PCV2 Cap蛋白刺激细胞因子转录水平变化的研究，主要包括IL-2、IFN-γ、IL-10等[6,11-12]，还未见关于IL-21和IL-17A的报道。因此，以猪IL-17A和IL-21基因为研究对象，检测PCV2 Cap蛋白刺激的PBMCs中IL-17A和IL-21的转录水平，并初步研究调节IL-17A和IL-21的机制，为后期开发疫苗增强剂以及研究PCV2 Cap蛋白刺激过程中IL-21与其他细胞因子的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 3月龄健康的PCV2抗体阴性的长白仔猪2头，体重为15 kg，购自新乡某猪场。

1.1.2 PCV2 以及PCV2 Cap蛋白 PCV2由新乡学院生命科学与基础医学学院和生物技术研究中心从临床分离、保存；PCV2 Cap蛋白由新乡学院生命科学与基础医学学院和生物技术研究中心制备、保存。

1.1.3 主要试剂 RNA抽提试剂盒、cDNA反转录试剂盒、dNTPs和TB Green Premix Ex Ⅱ（宝生物工程（大连）有限公司），Trizol（北京索莱宝生物科技有限公司）。

1.1.4 主要仪器 倒置显微镜（德国ZEISS公司）、荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher公司）、超纯水仪（美国MILLIPORE公司）、全自动制冰机（日本Panasonic公司）、大容量水平离心机（美国Thermo Fisher公司）、微型离心机（北京昊诺斯生物有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1IL-21和IL-17A实时荧光定量PCR引物的设计与合成 根据 GenBank中β-actin、IL-17A、IL-21和PD-L1的基因序列，使用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR特异性引物，用于扩增目的片段，引物设计后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 IL-21、IL-17A和 β-actin的实时荧光定量PCR引物序列

1.2.2 实时荧光定量PCR检测PCV2感染猪PBMCs中IL-21和IL-17A基因的转录变化 通过前腔静脉采集健康猪抗凝血，按照何勇等[13]的方法分离PBMCs。将获得的PBMCs在37℃、5%的CO2培养箱中培养。利用PCV2体外感染PBMCs后，分别在感染后12、24、36、48、60、72 h收取细胞，采用RNA提取试剂盒提取PCV2感染后PBMCs的RNA，进行反转录。反转录步骤如下：37℃孵育15 min，85℃水浴5 s，4℃冷却，即为cDNA。利用设计的实时荧光定量PCR引物，进行β-actin、猪IL-17A和IL-21的实时荧光定量PCR，检测IL-17A和IL-21的表达水平。实时荧光定量PCR扩增体系（总体积20 μL）：TB Green Premix Ex Ⅱ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，DNA 2 μL，无菌水6 μL。实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃反应34 s，共40个循环。每次循环结束进行荧光信号的检测，每个样品3个重复。以β-actin作为内源性对照，采用2-ΔΔCt分析方法计算IL-21和IL-17A的相对表达值，并将正常对照组时mRNA含量定义为1倍，可得出不同时间点IL-21和IL-17A的转录水平。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测PCV2 Cap蛋白刺激猪PBMCs中IL-21和IL-17A基因的转录变化 将PCV2 Cap蛋白按0.2 μg/mL刺激分离的PBMCs，同时设置细胞对照，每个样品3个重复，轻轻摇匀，放入37℃、5%CO2恒温培养箱中吸附培养60 min；用PBS洗去未吸附的蛋白，将处理后的PBMCs加入RPMI1640培 养 基（包 含 有6 μg/mL的ConA、2%的 胎牛血清、无菌PCV2抗体阴性猪血清）进行培养；分别在12、24、36、48、60、72 h收取细胞，按照1.2.2建立的方法检测PCV2 Cap蛋白刺激的猪PBMCs中IL-21和IL-17A的转录水平，分析其转录水平变化情况。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激猪PBMCs中PD-L1基因的转录水平变化 为研究IL-21和IL-17A基因转录水平变化的机制，根据Yue等[14]建立的实时荧光定量PCR方法，检测PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激的猪PBMCs中PD-L1基因的转录水平变化情况，初步分析IL-21和IL-17A基因转录水平变化的调节机制。

1.3 数据的统计分析

采用IBM SPSS Statistics 26软件进行统计分析，试验数据以“平均值±标准误”表示，并用独立样本t检验分析结果进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR检测PCV2刺激猪PBMCs中IL-21和IL-17A基因的转录变化水平

如图1所示，IL-21和IL-17A基因的转录水平均明显上调，并且在60～72 h上调最明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，48 h转录水平达到最低值。IL-21mRNA在12～24 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，如图1A所示。IL-17A mRNA在12～36 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，48 h达到最低值，如图1B所示。因此，由图1可知，PCV2刺激PBMCs后IL-21和IL-17A的转录水平明显上调，并且在12～24 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），60 h达到峰值，其中48 h降低至最低。以上结果说明PCV2在体外能够提高细胞因子IL-21和IL-17A基因的转录水平。

图1 PCV2刺激猪PBMCs中IL-21和IL-17A的转录变化

2.2 实时荧光定量PCR检测PCV2 Cap 蛋白刺激猪PBMCs中IL-21和IL-17A基因的转录变化水平

如图2所示，IL-21和IL-17A基因的转录水平均明显上调，并且在60～72 h上调最明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，48 h转录水平达到最低值。IL-21mRNA在12～24 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，48 h达到最低值，甚至低于正常细胞的转录水平，如图2A所示。IL-17A mRNA在12～36 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），其中60 h转录水平达到峰值，48 h达到最低，如图2B所示。因此，由图2可知，PCV2 Cap蛋白刺激后IL-21和IL-17A基因转录水平明显上调，并且在12～24 h、60～72 h上调明显（P＜0.01），60 h达到峰值，其中48 h降低至最低。以上结果说明PCV2 Cap蛋白在体外能够模拟PCV2提高细胞因子IL-21和IL-17A基因的转录水平，并且对IL-21转录水平提高更明显，几乎是PCV2刺激后转录水平的2倍。

图2 PCV2 Cap 蛋白刺激猪PBMCs中IL-21和IL-17A的转录变化

2.3 实时荧光定量PCR检测PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激猪PBMCs中PD-L1基因转录变化水平

按照Yue等[14]的检测方法和计算方法检测PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激猪PBMCs后PD-L1基因的转录水平，结果如图3所示。PCV2刺激PBMCs后PD-L1的转录水平明显上调，并且在48～72 h上调最明显（P＜0.01），48 h达到峰值（图3A）；PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs后PD-L1的转录水平在12 h和60 h明显上调（P＜0.01），12 h达到峰值（图3B）。但是，比较PCV2和PCV2 Cap蛋白对PD-L1的转录水平的影响，发现PCV2显著提高PD-L1的转录水平（P＜0.01），几乎是PCV2 Cap 蛋白刺激时的2倍，这与前期关于PCV2自然感染猪时PD-L1的研究结果相一致[14]。以上结果说明PCV2 Cap 蛋白能够模拟PCV2提高PD-L1的转录水平，但是转录水平低于PCV2刺激时的转录水平。

图3 PCV2 和PCV2 Cap 蛋白刺激猪PBMCs中PD-L1的转录水平的变化

3 讨 论

IL-21与其他的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-15等的空间结构一致，其受体为IL-21R（interleukin-21 receptor），与IL-2家族具有相同的结构特征，归类于IL-2家族。在正常细胞中IL-21不表达，当细胞转变为活化状态时IL-21才表达。链霉菌属的抗生素或其他类似抗体等，都可以诱导IL-21的表达。IL-21主要是由活化的 CD4+T（主要是Th2）细胞、NKT细胞及树突状细胞分泌[15]，Th17细胞也分泌表达[16]。IL-21发挥其各种功能时，需要与他的受体IL-21R结合。IL-21对所有的淋巴细胞都有调节效应，主要是影响 CD4+ T细胞的发育、促进B细胞的增殖分化、调节B细胞的类型转换和抗体分泌，还可促进CTL细胞数量的增加，诱导CD8+T 和NK细胞的细胞毒性效应和功能，强化细胞毒活性等，使其在感染性疾病中发挥重要作用。猪IL-21基因是在猪第8号染色体上，其cDNA全长共456 bp[17]。猪IL-21基因在同源性上与人和某些动物的氨基酸序列具有相似性，其中，与牛同源性最高，其次是人，最低的是鼠。

目前PCV2疫苗研究主要集中在疫苗抗原的研究，如通过各种表达系统，获得PCV2 Cap 的重组蛋白，用于疫苗抗原的制备。武乐祎等[18]通过CHO-K1系统制备了PCV2 Cap蛋白，能够刺激小鼠产生较高水平的抗体。通过分析比较，发现PCV2 Cap 蛋白能够和PCV2一样刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因转录水平变化，说明PCV2 Cap蛋白具有PCV2抗原的特性。同时还发现PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21基因的转录水平升高，是PCV2刺激后转录水平的近2倍。而IL-17A基因的转录水平和PCV2刺激后的转录水平基本保持一致。以上研究进一步表明，前期制备的PCV2 Cap蛋白能够模拟PCV2的病毒粒子，刺激IL-21和IL-17A基因转录水平的上升。又由于IL-21发挥正向免疫调节的作用，因此，可以将Cap作为PCV2疫苗抗原的候选抗原，用于PCV2疫苗的研究。

利用猪IL-21和IL-17A基因的实时荧光定量PCR检测方法，检测PCV2和PCV2 Cap蛋白体外刺激后PBMCs中IL-21和IL-17A基因的转录水平。结果显示，PCV2 Cap蛋白和PCV2刺激后，猪IL-21和IL-17A的转录水平显著升高，在第60 h达到峰值；IL-21的转录水平在48 h降至最低，甚至低于正常水平，这可能是由于IL-21的表达水平受PD-1∶PD-Ls通路的调节，IL-17A的表达水平又受IL-21的调节。PD-L1的转录水平在48 h达到峰值，导致IL-21的转录水平最低值。这个研究结果与Zhang等[19]研究流感病毒H9N2病毒粒子感染的结果一致，当感染流感病毒H9N2的病毒粒子后，PD-L1的转录水平在24 h达到峰值，但转录水平远低于流感病毒H9N2感染时的转录水平。又有研究证明，IL-21和IL-17A的表达受PD-1∶PD-L1通路的调节[17]。PCV2自然感染过程中，PD-L1的表达水平升高更明显，发挥主要作用[14]，导致机体的免疫抑制。因此，将PD-L1作为检测对象，研究PD-L1与IL-21、IL-17A的关系。通过检测PD-L1的转录水平，发现PCV2 Cap蛋白能模拟PCV2刺激PD-L1转录水平变化，但是与PCV2感染时转录水平变化趋势并不完全一致，并且PCV2刺激时PD-L1的转录水平更高；PCV2 Cap蛋白与PCV2刺激PBMCs时，PD-L1的转录水平变化调节IL-17A和IL-21基因的转录水平。因此，PD-L1转录水平的升高，刺激IL-17A和IL-21基因的转录水平升高，当升高到一定水平时则发挥抑制作用。但是，目前PCV2 Cap蛋白刺激时PD-L1的转录水平变化与IL-17A和IL-21基因转绿的调节机制还不清楚，这需要后期进一步研究证实，这也是目前课题重点研究的内容。

综上所述，PCV2和PCV2 Cap蛋白在体外能够刺激PBMCs，导致PD-L1、IL-17A和IL-21基因的转录水平升高，其中PCV2 Cap蛋白导致IL-21基因的转录水平升高更多，几乎是PCV2 刺激时的2倍；IL-17A基因的转录水平基本和PCV2刺激保持一致，PD-L1的转录水平没有PCV2刺激时的转录水平高。以上研究为后续研究PCV2 Cap蛋白刺激的IL-21与IL-17A和其他细胞因子的关系以及对机体免疫功能的影响奠定了理论基础。