内蒙古赤峰地区传统发酵乳制品中乳酸菌的分离与鉴定

刘逸群，党娜，武岳，丛琳，刘文俊，孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

0 引 言

内蒙古赤峰市巴彦温都尔苏木游牧区一直保留着游牧的传统，有制作和食用自然发酵乳制品的习俗[1]。有酸奶、奶豆腐和酸奶油等[2-3]。Dehghan等[4]研究表明，每天摄入多于2份乳制品可降低死亡率和心血管系统疾病的风险。

乳酸菌是一类能发酵碳水化合物产乳酸的革兰氏阳性细菌的总称[5]，是有益菌。乳酸菌可提升机体免疫力、降低胆固醇、调解高血脂高血压、抗衰等功能[6]。其功效体现为促进机体生长，改善肠胃功能等[7]。优良的乳酸菌可赋予发酵乳制品良好的酸度、质构和风味[8-10]。

本研究通过纯培养方法与16SrRNA基因序列分析方法，对来自赤峰地区乳制品中的乳酸菌进行分离纯化和鉴定，深入了解该地区乳制品中乳酸菌的组成和种类，为制作乳制品提供理论依据与菌种资源。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本实验室研究人员于2019年9月份在巴彦温都尔苏木游牧区采集了3种传统发酵乳制品共15份样品，具体采样信息如表1所示。

表1 内蒙古赤峰地区采样信息

1.1.2 培养基与试剂

乳酸菌分离纯化及计数培养基：MRS Agar、MRS Broth，购自英国Oxoid公司；M 17 Agar、M 17 Broth，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

生理盐水：质量分数为0.85%的NaCl，分析纯，购自天津市汇杭化工科技有限公司。

PBS稀释剂：质量分数为0.8%NaCl，质量分数为0.115%的Na2HPO4·12H2O，质量分数为0.02%的KH2PO4，分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。

脱脂乳保护剂（100 mL）：瓶1：脱脂乳粉8 g、蒸馏水72 mL；瓶2：酵母粉2 g、蒸馏水18 mL。蒸汽锅灭菌条件为121℃（7 min），97℃时打开蒸汽灭菌锅将瓶1和瓶2用蒸馏水急冷，用时混匀即可。

细菌DNA提取试剂盒：包括Buffer GA，Buffer GB，Buffer GD，Buffer PW，Buffer TE，Proteinase K，溶菌酶溶液，购自北京市天根生物技术有限公司。

PCR扩增和电泳检测试剂：聚合酶（easy taq DNA），Mg2+缓冲液（10×easy taq PCR），高纯度d NTPs（每种浓度为2.5 mmol/L），电泳缓冲液贮液（5×TBE），琼脂糖凝胶（0.8%~1.2%），核酸染料（GELVIEW），λDNA/Hind III Marker、QDL2,000 Quan·titative DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司和大连宝生物技术有限公司（TaKaRa®）。

1.2 方法

1.2.1 样品的收集

收集样品采用直接取样法。取约5.0 g样品于装有0.5 g灭菌中和剂的灭菌螺口冻存管中并混合均匀，旋紧冻存管帽并用PARAFILM“M”®封口膜进行封口处理，对样品进行编号并标注，于4℃便携式冰箱内运回实验室待研究，以此确保样品中乳酸菌的种类、数量以及存活率达到最高。

1.2.2 样品中乳酸菌的计数、分离纯化及菌株保藏

10倍稀释法进行梯度稀释，乳酸菌计数和分离分别采用倾注法、涂布法[11]。计数板和涂布板冷却凝固后倒置平板于厌氧工作站（气体条件：CO2∶H2∶N2=10%∶10%∶80%）中37℃培养48 h。计数板按梯度计算即为每毫升样品的菌落数[12]；从涂布板上挑选出菌落形态明显不同的单菌落于相对应的液体培养基中选择革兰氏阳性的纯培养物加入灭菌脱脂乳保护剂，分装于冻存管和无菌安瓿管中，用液氮速冻处理后于-80℃冰箱中冻存备用[13]。

1.2.3 基因组DNA提取及16SrRNA基因的PCR扩增

用TIANamp Bacteria DNA Kit提取基因组DNA，用ND-2000C微量紫外分光光度计测其浓度和OD260/280值。

PCR扩增体系：5μL10×Easy Taq Buffer(Mg2+)；4μL High Pure d NTPs（2.5 mmol/L）；1.5μL引物FA-27F（浓度为10 mmol/L）；1.5μL引物RA-1495R（浓度10 mmol/L）；0.5μLEasy Taq DNA polymerase（5 U/μL）；2μL DNA模板（质量浓度100 ng/μL）；35.5μL dd H2O。PCR扩增采用细菌16SrRNA基因通用引物[14]，正、反向引物序列如下：

FA-27F:5'-GCAGAGTTCTCGGAGT-CACGAAGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3'；

RA-1495R:5'-AGCGGATCACTTCACA-CAGGAC TACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR扩增循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃末端延伸10 min。

1.2.4 16SrRNA序列测定和构建系统发育树

将PCR产物送到上海美吉生物技术有限公司进行双向测序，运用DNAStar 6.1软件包中的SeqMan软件将其进行拼接，最终获得1 400 bp的有效序列。利用Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）软件将测定的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知分类地位的乳酸菌基因序列进行同源性比较。应用于软件Mega 6.0中的Cluster W首先将模式菌株和所测菌株的16SrRNA基因序列进行多重序列比对，在此基础上采用Neighbor-Joining构建系统发育树[15]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的计数结果

内蒙古赤峰地区发酵乳制品样品中乳酸菌的活菌数见表2，活菌数可以反应样品的新鲜程度以及在运输、储存过程中乳酸菌的存活状况。由表2可知，内蒙古赤峰地区发酵乳制品样品中活菌数在6.68~9.56 m L-1（对数值）之间，平均值为(8.14±0.11)m L-1（对数值），所有发酵乳制品样品的活菌数均高于1×106mL-1,可见内蒙古赤峰地区的细菌发酵乳制品的样品菌株新鲜度相对较高,菌株的存活适应能力强，有利于开展下一步的细菌分离鉴定与科学研究等相关工作。

表2 内蒙古赤峰地区样品中乳酸菌的计数结果

（续表2）

2.2 乳酸菌分离株的菌落形态及表型特征

根据菌落的形态特征，革兰氏染色实验结果为阳性，因此将分离纯化到的116株菌初步定为乳酸菌。在涂布板上菌落形状呈圆形、大小中等，中心凸起，颜色为白色或乳白色，边缘整齐，表面有的光滑，有的粗糙。

2.3 菌种DNA提取和16SrRNA扩增结果

纯DNA样品OD260/280值应在1.8~2.0之间，将其质量浓度稀释至100 ng/μL后进行16SrRNA基因扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测可观察到在1 500 bp处有一条清晰明亮的条带且无弥散及明显非特异扩增现象，如图1所示。

图1 16SrRNA基因的PCR扩增产物电泳结果

2.4 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定结果

由图2可知，N 4-5和模式株Enterococcus faeciumNBRC 100485T聚类，同源性为99%，可归为Enterococcus faecium。L5-2和模式株Enterococcus duransNBRC 100479T聚类，同源性为99%，可归为Enterococcus durans。A9-6和模式株EnterococcusmundtiiNBRC 100490聚类，同源性为99%，可归为Enterococcus mundtii。Y3-3和模式株Enterococcus faecalisNBRC 100480T聚类，同源性为100%，故鉴定为Enterococcus faecalis。L9-7和模式株EnterococcuscasseliflavusNCIMB 11449T聚类，同源性为99%，可归为Enterococcuscasseliflavus。Y2-6和模式株Lactococcus lactisATCC19435T聚类，同源性为100%，故鉴定为Lactococcus lactis。S1-12和模式株Streptococcus salivariusATCC 7073聚类，同源性为100%，故鉴定为Streptococcussalivarius。L2-3和模式株PediococcusacidilacticiDSMZ 20284T聚类，同源性为100%，故鉴定为Pediococcusacidilactici。A7-2和模式株Lactobacillus plantarumATCC 14917T聚类，同源性为100%，故鉴定为Lactobacillus plantarum。L9-1和模式株Weissella cibariaLMG 17699聚类，同源性为100%，故鉴定为Weissella cibaria。Y3-4和模式株Leuconostoc pseudomesenteroidesNCDO 768聚类，同源性为100%，故鉴定为Leuconostoc pseudomesenteroides。S1-8和模式株Leuconostoc mesenteroidesJCM 6124T聚类，同源性为100%，故鉴定为Leuconostoc mesenteroides。

图2 内蒙古赤峰地区代表性分离株的16SrRNA基因序列的系统发育树

2.5 优势菌种分析

乳酸菌的分离结果由表3所示。由表3可知，本研究分离的116株乳酸菌被鉴定为7个属13个种，包括66株Lactococcus，26株Lactobacillus，14株Enterococcus，4株Pediococcus，3株Leuconostoc，2株Streptococcus，1株Weissella。除L2和L5外，其他样品均分离到Lactococcus lactis，共65株，占总分离株56%，是本研究样品中的优势菌种。6份酸奶油样品均分离到Lactococcus lactis，共31株，占总分离株27%，Lactococcus lactis优势菌种；其中Y1、Y2、A7、A8、A9这5份酸奶油样品均分离到Lactobacillus plantarum，共20株，占总分离株17%，Lactobacillus plantarum为第二优势菌种。5份酸牛奶样品均分离到Lactococcus lactis，共29株，占总分离株25%，Lactococcus lactis为优势菌种。4份奶豆腐样品中，L2主要分离到Pediococcusacidilactici，Enterococcus faecium；L5主要分离到Lactobacillus plantarum，L7和L9主要分离到Lactococcus lactis。而其他菌种Lactococcus garvieae、Enterococcus durans、Enterococcus mundtii、Enterococcus faecalis、Enterococcus casseliflavus、Leuconostocmesenteroides、Weissella cibaria在样品中分离数量很少。

表3 内蒙古赤峰地区传统乳制品中乳酸菌的分离结果

3 讨 论

传统发酵乳制品因其良好的保健与益生功能，近年来吸引着一批又一批学者对其乳酸菌菌群结构进行了深入研究。本研究通过对收集的15份样品进行了乳酸菌的分离纯化与鉴定工作，证实了这其中乳酸菌的种类及数量多样。Lactococcus lactis占总分离株的56%，是内蒙古赤峰地区发酵乳制品样品中的优势菌种，此外，Lactobacillus plantarum分离的也较多。乳酸菌分离株的相对含量如图3所示。

图3 内蒙古赤峰地区传统发酵乳制品中乳酸菌分离株的相对含量

6份酸奶油样品中，被分离到的乳酸菌鉴定为4个属Lactococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Enterococcus，其中Lactococcus lactis是优势菌种，Lactobacillus plantarum是第二优势菌种。Mourad等[16]从阿尔及利亚撒哈拉地区20份酸奶油样品中共分离181株乳酸菌，包括40株Lactobacillus plantarum，35株Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus，22株Lactococcus lactis subsp.lactis，18株Lactococcus lactissubsp.Cremoris，10株Lactobacillus paracasei，其中Lactobacillus plantarum为优势菌种。Idoui等[17]研究阿尔及利亚东部地区酸奶油样品，乳酸菌被鉴定为3个属Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus，其中Lactococcus lactissubsp.Diacetylactis为优势菌种。通过和其它地区对酸奶油中乳酸菌的研究比较[16-17]，内蒙古赤峰地区酸奶油中乳酸菌种类较少，这可能和酸奶油的制作工艺，产地的自然环境相关。

5份酸牛奶样品中，鉴定为5个属Lactococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Leuconostoc和Streptococcus，其 中Lactococcuslactis为优势菌种。卿蔓君等[18]从内蒙古东部地区的酸牛乳中研究发现Lactobacillus helveticus、Lactococcus lactis subsp.lactis、Lactobacillus casei、Leuconostoc mesenteroidessubsp.Mesenteroides为样品的优势菌种。Watanabe等[19]和Takeda等[20]从内蒙古自然发酵牛乳中研究发现Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus是优势菌种。Xu等[21]和Liu等[22]研究发现，地理位置不同，传统发酵牛奶中微生物的多样性也会有所差异。而本研究酸牛奶样品中优势菌种为Lactococcus lactis，这可能和地理位置、自然条件不同有关。

4份奶豆腐样品中，分别为鉴定为5个属Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、、Weissella、Lactobacillus。呼斯楞等[23]对内蒙古呼伦贝尔地区传统发酵乳制品进行研究发现Lactococcus lactissubsp.lactis是该地区发酵乳制品中的优势菌种。雷霞等[24]从内蒙古伊敏河岸和海拉尔河岸牧区自然发酵乳制品中共分离33株乳酸菌，被鉴定为4个属Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus、Leuconostoc，其中Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactissubspLactis是优势菌种。Sun等[25]对内蒙古、四川、甘肃及蒙古国17份传统酸奶样品通过高通量测序技术研究发现，菌群的多样性和地理位置是密不可分的。综上所述，地理位置、自然环境条件、制作工艺的不同，传统发酵乳制品中乳酸菌的种类与数量也会有所差异。

4 结 论

本研究从3种发酵乳制品15份样品中共分离出116株乳酸菌，经16SrRNA序列测定及同源性分析，鉴定为7个属13个种。分别为66株Lactococcus，26株Lactobacillus，14株Enterococcus，4株Pediococcus，3株Leuconostoc，2株Streptococcus，1株Weissella。而Lactococcus lactis占总分离株的56%，是内蒙古赤峰地区发酵乳制品中的优势菌种。