发酵过程中不同理化因素对乳酸菌噬菌体的影响

于晓丽，赵莉，程溪，秦松跃，狄亚心，崔文，姜艳平，王丽，李一经，唐丽杰，徐义刚，周晗，乔薪瑗

(东北农业大学动物医学学院动物疾病防控技术与制剂创制实验室，哈尔滨150030）

0 引 言

乳酸菌作为益生菌，广泛应用于食品发酵及饲料加工业，在功能食品、医疗保健、微生态制剂等许多领域也具有较好的应用前景[1-4]。乳酸菌具有提高机体免疫力、调节肠道微生态平衡[5]、促进机体新陈代谢[6]等功能，对机体发挥着不容忽视的作用。乳酸菌定植肠道与自由基结合，可降低对机体的损害[7]，且菌体及其提取物均具有抗氧化作用[8]。乳酸菌长期用于食品发酵，已被证明不具有致病性，被公认为安全级微生物[9]。但是乳杆菌在发酵过程中的不同阶段均受到噬菌体污染的威胁，导致发酵周期延缓、产量下降甚至全部浪费，造成严重的经济损失[10-11]。

在食品加工、化学制药、饲料生产和生物技术等行业，噬菌体污染问题被广泛报道[12]。减少或消除噬菌体污染，成为研究者非常关注的问题[13]。在发酵生产的不同阶段若发生噬菌体侵染，会导致乳酸菌产酸量减少，发酵过程缓慢或产品产量、质量下降等，造成巨大的经济损失[14]。Cox首次报道了噬菌体侵染发酵剂，在该领域取得显著进步，特别是在噬菌体遗传学、生态学及抵抗外界环境因素方面[15]，随后又有相关文献[16]报道了干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的噬菌体导致乳品发酵失败；近来年，对噬菌体侵染酸奶和奶酪的报道[17-19]变得越发频繁，造成严重的经济损失。目前，噬菌体污染仍然是影响发酵工业的一个难题。

本研究通过分析环境中不同理化因素对3株乳酸菌噬菌体的影响，为控制发酵生产中噬菌体污染、保护工业菌株、制定有效防控措施提供理论依据。通过对发酵介质中理化因素对噬菌体及宿主菌的影响分析，为筛选抑制噬菌体活性且不影响发酵过程的有效措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

干酪乳杆菌（L.casei ATCC 393）戊糖乳杆菌（L.pentosus KLDS 1.0413）短小乳杆菌（L.brevis ATCC 367），由本实验室保存。噬菌体Lc、Lpen和Lbre；均由本实验室保存。

1.1.2 主要实验仪器与设备

垂直板电泳系统BIO-RADMV120型，Savant Instruments；低温台式高速离心机Z323，HERMAL公司；电热恒温培养箱DNP-9162型，上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水槽DK-80型，上海精宏实验设备有限公司；凝胶成像仪UVR-800 Uitra-Uiolet Procducts Limted Cambhdge，UK吉尔森公司；微量电子天平BS201S型，北京赛多利斯公司；透射电子显微镜H-7650型，日本日立公司。

1.1.3 培养基配制

试验过程中使用的主要培养基见表1。

表1 主要培养基及其配方

1.2 试验方法

1.2.1 发酵过程中p H对宿主菌和噬菌体的影响

取不同p H值（p H=2~11）的MRS培养液98 m L，分别接种L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413和L.brevis ATCC 367菌液2 mL，37℃静置培养18 h，测定OD600值。再将不同p H值（p H=2~14）的900μL MRS培养液中分别添加100μL噬菌体，混匀，32℃温育30 min，以L.casei ATCC 393为指示菌，以MRS固体培养基做下层培养基，将原液10倍比稀释后取100μL接种100μL指示菌，再将混合液接种4 mL MCM半固体培养基做上层培养基，制成双层琼脂平板，对形成的噬菌斑进行计数，测定噬菌体的效价，计算噬菌体存活率。实验重复3次。

1.2.2 发酵过程中温度对宿主菌和噬菌体的影响

为了减少发酵食品中乳酸菌菌种的使用、缩短发酵时间，对菌种最适生长温度进行测定，本试验选取发酵过程中常用温度,取MRS培养液98 mL，分别接种L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413和L.brevis ATCC 367菌液2 mL，将其置于32、37、45、56℃条件下进行培养，每隔2 h测定其OD600值，绘制在不同温度下的生长曲线。为了测定噬菌体的热稳定性，筛选出利于乳酸菌发酵但不利于噬菌体生长的温度，参照Capra[20]等所描述的方法，用MRS培养宿主菌后，再分别感染3种噬菌体，噬菌体裂解宿主菌，收取裂解液，分别置于32、37、45、56℃和63℃温度下作用，于2、5、10、15、30、45 min和60 min分别取样，12 000×g离心4 min，取100μL上清进行十倍比梯度稀释，测定噬菌体效价。实验重复3次。

1.2.3 发酵介质中二价阳离子对宿主菌和噬菌体的影响

取MCM、MRS-Ca、MRS-Mg、MRS液体培养基98 mL，每一种培养液均分别接种L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413和L.brevis ATCC 367菌液2 mL，置于37℃静置培养18 h后测定其OD600值。参照Quiberoni等[21]所使用的方法，用MRS培养噬菌体，获得噬菌体裂解液，采用双层平板法制斑，其中上层分别为MCM、MRS-Ca、MRS-Mg、MRS半固体培养基，下层均为MRS固体培养基。32℃静置培养，测定噬菌体的效价。

1.2.4 发酵介质中NaCl对宿主菌和噬菌体的影响

在MRS培养基中添加质量浓度1%、2%、3%、5%NaCl，取添加质量浓度1%、2%、3%、5%NaCl的MRS培养液各98 mL，分别接种L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413和L.brevis ATCC 367菌液2 mL，37℃静置培养18 h，测定OD600值。参照Capra等[20]使用的方法，用MRS培养3种噬菌体,将终浓度为106PFU/m L噬菌体裂解液置于上述不同浓度NaCl发酵液中，32℃孵育4 h，测定噬菌体的效价。

1.2.5 发酵介质中聚山梨醇酯类（T-20）对宿主菌和噬菌体的影响

取MRS培养基添加T-20，体积分数分别为0.01%、1%、2%，将其平均分为两组，取添加积分数分别为0.01%、1%、2%T-20的MRS培养液各98 mL，分别接种L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413和L.brevis ATCC 367菌液2 mL，第二组除接种等量菌液外，按最佳感染复数（motiplicity of infection MOI）接种对应的噬菌体，32℃培养过夜，第一组分别测定菌液OD600值，第二组培养液经12 000×g离心4 min，收集噬菌体裂解液，10倍比稀释后制斑，测定此时噬菌体效价。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中不同p H对宿主菌和噬菌体的影响结果

2.1.1 发酵过程中p H对宿主菌的影响结果

在p H=5~9范围内3株乳酸菌均可正常生长，具有较强的嗜酸性。当p H=2或10时均不能生长，p H等于3时差异极显著，pH等于4时差异显著，均不能正常生长，p H等于9时差异不显著乳酸菌可以正常生长，表明对强酸、强碱较敏感。结果如图1所示。

图1 不同pH对宿主菌存活率的影响

2.1.2 发酵过程中p H对噬菌体的影响结果

在发酵介质中，不同p H对Lc、Lpen及Lbre的影响结果如图2所示。当pH=2时，Lc完全灭活，Lpen效价下降1个数量级，Lbre效价下降4个数量级；当p H=3~10时，3株噬菌体均表现出完全抗性；当pH=11~14时，3株噬菌体效价均急剧下降，最终完全灭活。

图2 不同pH对噬菌体效价的影响

2.2 发酵过程中温度对宿主菌和噬菌体的影响结果

2.2.1 发酵过程中温度对宿主菌的影响结果

3株乳酸菌L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS1 0413和L.brevi s ATCC 367分别于32、37、45℃和56℃进行生长曲线的测定，当温度为32℃和37℃时，3株乳酸菌均正常生长，且37℃时生长状态略好；当温度为45℃时，与37℃相比，差异极显著，3株乳酸菌均生长缓慢，生长速度L.casei ATCC 393>L.pentosus KLDS1.0413>L.brevis ATCC 367；当温度为56℃时，与37℃相比，差异极显著，3株乳酸菌均不能正常生长，结果如图3~图5所示。

图3 温度对L.casei ATCC 393的影响

图4 温度对L.pentosus KLDS1.0413的影响

图5 温度对L.brevi s ATCC 367的影响

2.2.2 发酵过程中温度对噬菌体的影响结果

发酵介质不同温度对Lc的影响结果如图6所示，37℃时表现出完全抗性；45℃处理5 min，15%噬菌体失活，处理30 min，60%噬菌体失活，处理60 min后，70%噬菌体失活；56℃处理5 min后，可使98%Lc灭活，处理10 min后几乎全部灭活；63℃处理2 min即可完全灭活。

图6 发酵介质中温度对噬菌体Lc的影响

发酵介质不同温度对Lpen的影响结果如图7所示，当温度为32℃和37℃时，均表现出完全抗性；45℃时处理15~60 min，15%~20%噬菌体灭活；56℃作用处理45 min后，可使其全部灭活；63℃处理2 min即可完全灭活。

图7 发酵介质中温度对噬菌体Lpen的影响

发酵介质不同温度对Lbre的影响结果如图8所示，当温度为32℃时，表现出完全抗性；37℃处理2~10 min，可使其10%灭活；处理30~60 min，可使其30%灭活；45℃作用5~10 min，可使其30%灭活，作用60 min后，可使其70%灭活；在56℃及63℃温度下分别处理5 min和2 min即可使噬菌体全部灭活。

图8 发酵介质中温度对噬菌体Lbre的影响

2.3 发酵介质中二价阳离子对宿主菌和噬菌体的影响结果

2.3.1 发酵介质中二价阳离子对宿主菌的影响结果

发酵介质中添加Ca2+和Mg2+对宿主菌的影响结果如图9所示，L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS1.0413、L.brevis ATCC 367在MCM、MRS-Ca、MRS-Mg、MRS 4种培养基中的菌浓度均无明显变化，差异不显著，发酵液体介质中添加钙、镁离子未影响宿主菌的正常生长。

图9 钙、镁离子对宿主菌的影响

2.3.2 发酵介质中二价阳离子对噬菌体的影响结果

发酵介质中Ca2+和Mg2+对噬菌体的影响结果如图10所示，上层为未添加Ca2+和Mg2+的MRS培养基时，噬菌体效价与MCM、MRS-Ca、MRS-M g 3组相比明显降低。其中，未添加Ca2+和Mg2+使Lc效价下降2个数量级，Lpen和Lbre效价下降1个数量级；未添加Ca2+可使Lc效价下降1个数量级，Lpen效价略有降低，Lbre效价无明显影响。

图10 钙、镁离子对噬菌体的影响

2.4 发酵介质中NaCl对噬菌体和宿主菌的影响结果

2.4.1 发酵介质中NaCl对宿主菌的影响结果

在添加不同剂量NaCl的MRS培养基中，L.casei

ATCC393、L.pentosus KLDS 1.0413、L.brevis ATCC 367

均能正常生长，培养18 h后检测OD600。结果如图11所示，当NaCl浓度为2%时，L.casei ATCC 393菌液OD600最大（9.8673）；当NaCl浓度为1%时，L.pentosus KLDS 1.0413菌液OD600最大（9.5430）；当NaCl浓度为2%时，L.brevis ATCC 367菌液OD600最大（6.2780），与MRS组相比差异不显著,OD600数值均在乳酸杆菌正常生长的区间。

图11 不同浓度NaCl对宿主菌的影响

2.4.2 发酵介质中NaCl对噬菌体的影响结果

发酵液体介质中不同浓度NaCl对Lc、Lpen及Lbre的影响结果如图12所示。当1%NaCl作用Lc时，Lc效价未发生改变；当2%NaCl处理时，其效价下降1个数量级；当3%、5%NaCl作用Lc时，其效价下降2个数量级。当1%、2%NaCl作用Lpen时，其效价下降2~3个数量级；当3%NaCl作用Lpen时，其效价下降4个数量级，当5%NaCl处理时完全灭活。当不同浓度NaCl作用Lbre时，其耐受性较强，当NaCl浓度为3%和5%，效价下降一个数量级，但不能完全灭活。

图12 不同浓度NaCl对噬菌体的影响

2.5 发酵介质中T-20对噬菌体和宿主菌的影响结果

2.5.1 发酵介质中T-20对宿主菌的影响结果

不同浓度T-20对宿主菌L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS 1.0413、L.brevis ATCC 367的作用结果如图13所示。随着T-20浓度的增加，3株乳酸菌的菌浓度均有降低（2%>1%>0.1%），当T-20浓度为1%、2%时，菌浓度下降较明显，但差异不显著，可以保证发酵的正常进行。

图13 T-20对宿主菌的影响

2.5.2 发酵介质中T-20对噬菌体的影响结果

不同浓度T-20对噬菌体的影响结果如图14所示。0.1%、1%T-20可使Lc效价分别下降1个和2个数量级，2%T-20使Lc效价下降3个数量级；0.1%T-20处理Lpen时，其效价下降2个数量级，1%T-20处理时Lpen效价下降5个数量级，2%处理后可完全灭活；0.1%T-20处理Lbre时效价下降4个数量级，1%、2%T-20可使噬菌体Lbre完全灭活。

图14 不同浓度T-20对噬菌体的影响

3 讨 论

噬菌体污染的普遍存在常引起发酵失败，并导致严重的经济损失[22-23]。生产环境是影响发酵过程的重要因素之一，在发酵过程中，发酵液体的随意排放、发酵乳废弃以及洗罐后废水的不当处理等，会导致噬菌体污染发酵环境[24]。

噬菌体污染时，车间及厂区周围环境会有大量噬菌体残留，紫外消毒可有效控制发酵环境中的噬菌体污染。虽然紫外消毒覆盖面积大，操作便捷，但由于穿透力弱，对隐蔽或遮挡的发酵生产设备，例如工厂管道、发酵罐和种子罐等不能消杀彻底。发酵生产中常用的新洁尔灭（0.05%）、甲醛（0.1%）和高锰酸钾（KMnO4，0.05%）等生物灭活剂对噬菌体灭活效果非常显著[25-26]。有研究报道，对乳杆菌噬菌体MLC-A最有效的乙醇浓度为75%[13]。

在发酵过程中，介质中的相关因素对发酵过程具有重要的影响。在发酵生产中不同pH对噬菌体和宿主菌的影响不同，噬菌体对pH表现出高抗性，具有较强的耐酸、耐碱能力，但宿主菌耐酸不耐碱，并且噬菌体对p H的耐受范围与宿主菌相比较宽。因此，在发酵过程中，采用改变p H无法有效抑制噬菌体生长。另外，多数噬菌体对热处理较敏感，高温处理可破坏衣壳蛋白、裂解噬菌体。本研究将噬菌体Lc、Lpen、Lbre在56℃条件下分别作用10、45、5 min均被灭活；而宿主菌L.casei ATCC 393、L.pentosus KLDS1.0413和L.brevis ATCC 367在32℃和37℃下正常生长。综合发酵介质中温度对噬菌体与宿主菌的影响，在发酵生产中，可采取“先高后低”来设定温度，发酵初期将介质温度升至56℃及以上维持一段时间，然后通过制冷装置降至发酵菌株正常培养温度，完成发酵过程。

噬菌体在侵染宿主菌过程中，吸附阶段是首要过程。Sechaud等[27]指出Ca2+或M g2+不仅具有稳定噬菌体DNA螺旋结构、提高phage对宿主菌吸附率的作用，还可控制噬菌体DNA侵入宿主细胞。因此，二价阳离子Ca2+和Mg2+是噬菌体增殖必不可少的。本研究通过检测添加Ca2+或Mg2+对发酵过程的影响，结果表明，宿主菌在添加和未添加Ca2+或Mg2+时均能正常生长，但Lc、Lpen、Lbre在未添加Ca2+或Mg2+时，其效价下降2~4个数量级，且形成的噬菌斑较小。有研究报道，当噬菌体BYM、Ib3、YAB和MLC-A裂解菌体时，培养基中只有添加Ca2+和M g2+时，才能形成噬菌斑[28]。因此，在生产实践中，可考虑在发酵介质中添加络合物（如柠檬酸盐等）除去液体介质中多余的二价阳离子，阻断噬菌体对宿主菌的吸附，有效控制发酵过程中的噬菌体污染。

NaCl作为食品添加剂，不仅能改变发酵食品的口感质地，还可抑制噬菌体污染且不影响发酵菌株正常生长。在本研究中，当添加5%NaCl时发酵菌株浓度略有降低，但不影响发酵过程；当3%、5%NaCl处理Lc时，效价下降2个数量级，有效抑制其活性；当5%NaCl处理时，噬菌体Lpen完全灭活，Lbre无明显抑制作用。因此，在食品发酵生产中，可利用噬菌体对Na-Cl敏感性的不同，添加适宜浓度的NaCl来抑制噬菌体活性。T-20是一类非离子表面活性剂，常用于发酵过程中，减少泡沫的产生，被公认为安全、无毒、无刺激性的原料，每日允许摄入量为0~25 mg/kg（FAD/WHO，1985）。本研究选用不同浓度T-20对噬菌体及宿主菌共同作用，为了探究在合理浓度范围内添加T-20，是否可以控制发酵过程中噬菌体的污染，随着T-20浓度的增加，3株乳酸菌浓度略有降低（0.1%<1%<2%），但可以确保发酵过程顺利进行；当2%T-20作用Lc、Lpen、Lbre后，只有Lc效价下降3个数量级，而Lpen、Lbre均具有较强耐受性。因此，在生产实践中，可利用噬菌体对T-20的敏感性抑制其活性。

本研究通过分析发酵介质中不同理化因素对发酵过程的影响，为保护商业菌株、制定有效防控措施提供理论依据和实验数据，同时为深入了解探究噬菌体与宿主菌间的相互作用奠定基础。在生产实践中不同消毒剂和消毒方法各有优缺点，在发酵生产过程中，可联合应用多种方法，有效控制噬菌体污染，节约生产成本，提高生产效率。