马排卵期性激素含量变化及相关性分析

董 红，郑新宝，罗永明，陈 童，徐文慧，奴尔兰·阿克亚孜，范洪先

（1.新疆畜牧科学院 畜牧研究所，乌鲁木齐 830011；2.新疆伊犁国家农业科技园区管理委员会，新疆 昭苏 835600；3.昭苏县畜牧兽医发展中心，新疆 昭苏 835600）

在繁殖季节，母马在感受环境气温、光照变化的条件下，采食大量青草，膘情逐渐恢复，此时脑垂体释放促卵泡素（FSH），在FSH的不断作用下母马子宫上卵巢多个卵泡逐渐发育；此外母马卵巢还产生雌激素、促黄体生成素（LH）进入血液［1］。当血液中雌激素浓度不断升高时，则抑制脑垂体FSH、LH的释放。当FSH浓度开始不断下降后，在竞争生长条件下只有一两个卵泡发育成熟。LH的不断释放推动卵泡破裂成熟，卵子排出，然后进入发情交配、受精、妊娠阶段，一般母马怀孕产单胎，极个别为双胎［2-3］。为了深入研究母马发情季节生殖激素分泌变化规律，有必要进行排卵监测，这对诱导发情、实施同期发情有重要意义。

研究气候、品种、年龄、营养等因素对母马卵泡发育和排卵的影响［4-6］可以预测母马发情排卵时间，推测最佳配种时间。试验在卡拉苏马研究中心配种站选择发情母马122匹次，采集静脉血测定FSH、LH、绒毛膜促性腺激素（hCG）、促性腺激素释放激素（GnRH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）含量变化，并辅助直肠检查子宫卵巢、阴道状态及母马外观行为表现，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

试验于2016—2020年在昭苏县畜牧兽医站卡拉苏马研究中心马场进行。

1.2 试验动物及血液样品的采集

在配种季节，在卡拉苏马研究中心配种站选择发情母马122匹次，马群采用放牧方式饲养，使用一次性普通真空采血管，分别采集母马卵泡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期颈部静脉血，然后1 500 r/min离心5 min，血清冷冻保存，使用干冰运输，送至北京金海科隅生物科技发展有限公司，使用酶联免疫法检测血清中FSH、LH、hCG、GnRH、TRH含量［7］。

根据卵巢上卵泡的形状、大小、质地、波动和位置可判断卵泡发育情况，一般将马的卵泡期分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期，划分标准［8］如下：（1）卵泡Ⅰ期。一侧卵巢上出现小卵泡，直肠检查手接触有硬球的感觉，微突于卵巢表面，弹性强，无波动，排卵窝深。一般持续1～3 d。（2）卵泡Ⅱ期。小卵泡发育长大，卵泡液增多，卵泡柔软有弹性，直肠检查时触摸有微小波动感。排卵窝由深变浅。此期持续1～3 d。（3）卵泡Ⅲ期。卵泡继续长大，卵泡液更多了，直肠检查时触摸卵泡柔软，弹性好，波动明显，卵泡壁逐渐变薄，排卵窝较平。一般持续1～2 d。（4）卵泡Ⅳ期。卵泡长至最大，已成熟，直肠检查时手触能感觉到卵泡壁薄而紧张，有明显波动感，排卵窝浅。一般持续1.0～1.5 d。（5）排卵Ⅴ期。卵泡壁很薄，紧张，弹性弱，有一触即破感。此期一般持续2～8 h。有时直肠检查，触摸时卵泡突然破裂、排卵，可摸到排卵窝和卵泡膜。

1.3 激素的测定

酶联免疫吸附（ELISA）技术是一种应用广泛的检测方法，具有快速、敏感、特异性强、简便、易于标准化等优点，本试验采用ELISA测定血清激素含量。主要步骤：（1）取血清样品10μL加入酶标孔，加入样品稀释液40μL；（2）取标准品50μL加入酶标孔；（3）每孔加入酶标液100μL，盖上贴纸，放入37℃温箱反应1 h；（4）取出酶标板，用试剂盒自带洗液（洗液1∶25倍稀释）洗5遍，每遍间隔30 s，最后一遍甩干，在吸水纸上拍干；（5）每孔加入A液50μL，B液50μL，盖上贴纸放入温箱反应15 min；（6）取出酶标板加入终止液50μL，放入酶标仪检测（酶标仪检测选择450 nm波长条件），读取OD值［7-9］。

1.4 主要仪器和试剂

台式离心机、便携式B超仪、酶标仪、采血管、ELISA试剂盒、干冰。

1.5 数据的统计分析

采用Excel 2013软件整理数据并绘制不同采样期各种激素变化折线图；用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，并进行不同采样期的FSH含量、LH含量、hCG含量、GnRH含量、TRH含量 等指标之间的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 血清激素指标统计

各采样时期母马血清激素含量见表1。

表1 血清激素的描述性统计分析

由表1可以看出：FSH、LH、hCG含量在Ⅱ期至Ⅳ期持续上升，在Ⅳ期达到最高，之后下降；Gn-RH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，Ⅲ期至Ⅳ期上升，Ⅳ期至Ⅴ期下降；TRH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，之后上升，不同卵泡期差异显著（P＜0.01）。

2.2 血清激素指标相关性分析

对母马血清中激素含量进行相关性分析，结果见表2。

表2 不同采样期血清激素间的相关性分析

由表2可以看出：在Ⅱ期，TRH含量与GnRH、LH、FSH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01），GnRH与FSH含量呈显著相关（P＜0.05），hCG与LH、FSH含量呈极显著相关（P＜0.01），LH 和FSH含量呈极显著相关（P＜0.01）。

在Ⅲ期，TRH含量与GnRH、LH、FSH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01），GnRH与FSH、LH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈极显著相关（P＜0.01），LH和FSH含量呈极显著相关（P＜0.05）。

在Ⅳ期，TRH含量与GnRH、LH、FSH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈极显著相关（P＜0.01），LH和FSH含量极显著相关（P＜0.01）。

在Ⅴ期（排卵后），TRH含量与GnRH、FSH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01），GnRH与FSH含量呈极显著相关（P＜0.01），hCG与LH、FSH含量呈极显著相关（P＜0.01）。

3 讨论与结论

FSH和LH是一类糖蛋白激素，由母畜脑垂体促性腺激素细胞分泌，受下丘脑GnRH、雌激素、抑制素调控，推动着发情周期的周期性变化。FSH可以促进卵泡生长发育成熟及影响雌激素分泌，LH可以促进母马成熟卵泡排卵和黄体生长，促进黄体分泌雌激素、孕激素［10］。目前，有关哺乳动物的排卵详细机制尚未完全明确，对灵长类动物的研究表明：发情排卵前后时期动物体内FSH、LH、雌激素以及GnRH等激素变化明显，激素之间相互影响形成反馈调节，推动卵泡成熟、排卵，然后形成红体、黄体、白体。雌激素峰值出现，诱导下丘脑GnRH释放增加，推动LH、FSH达到分泌峰值。FSH和LH协同作用，诱导排卵时FSH和LH互相协同，使成熟卵泡破裂排卵。但单独使用LH会造成卵巢上成熟和不成熟的卵泡全部破裂，这种现象产生的确切机制还有待进一步研究［11］。

GnRH是一种神经激素，由下丘脑分泌，促进FSH、LH释放，排卵前LH分泌升高，推动雌激素分泌增多，雌激素刺激卵巢上受体合成多种酶，推动成熟卵泡顶部组织胶原纤维蛋白多糖变性，卵泡膜的黏合作用被破坏，卵泡液内蛋白水解酶、淀粉酶、胶原酶、透明质酸酶分泌增多，联合作用促使卵泡壁溶解破裂，成熟卵子排出［12］。

TRH是由下丘脑室旁核内的神经细胞合成分泌的一种肽类激素，可以促使促甲状腺激素（TSH）分泌增加，TSH的增多可以促进甲状腺的分泌，使动物体对性激素敏感性增加，身体发热，神经系统兴奋，表现发情症状［13］。

马的发情排卵主要发生在Ⅲ期～Ⅳ期，在本试验中，马群采用放牧方式饲养，比较难抓，采集同一匹放牧母马血样时，收集到的连续血样以Ⅱ期～Ⅴ期的为主，很少采集到Ⅰ期～Ⅱ期连续样本，血样数量不够，因此本试验重点对比分析马匹Ⅱ期～Ⅴ期的血液激素变化。

本试验结果表明：（1）在母马正常排卵期中卵泡Ⅱ期的FSH和LH、hCG是维持在低水平的，随着卵泡逐渐生长变大，FSH、LH、hCG激素含量在GnRH的诱导下持续上升，直至排卵前会迅速升高，LH、hCG在排卵期可升高2倍，而FSH则为2，3倍左右，在Ⅳ期达到最高，形成优势卵泡，然后卵泡破裂排卵，排卵之后进入Ⅴ期时FSH、LH、hCG激素含量迅速下降。（2）GnRH含量在Ⅱ～Ⅲ期有所下降，但差异不显著，在即将排卵时分泌量上升，促进FSH、LH分泌，推动优势卵泡排卵，排卵后含量又再次下降，FSH、LH含量也降低，卵巢恢复，开始准备下一个发情排卵周期。（3）TRH降低会引起母马甲状腺功能亢进，发情表现明显，并停止采食，频频靠近公马，嘶鸣，排卵后TRH含量升高，甲状腺功能减退，兴奋性逐渐下降，表现为安静排卵，接收公马爬跨配种。（4）不同采样期比较而言，在排卵前的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时，FSH和LH含量呈极显著相关，均为逐渐升高，排卵后迅速下降。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期hCG含量均与FSH、LH含量呈极显著相关（P＜0.01），总体上呈现先升高后降低的趋势。GnRH在Ⅱ期时与FSH含量呈显著相关（P＜0.05），表现为促进FSH分泌；Ⅲ期时，GnRH含量与FSH、LH、hCG含量呈极显著相关（P＜0.01）；Ⅴ期（排卵后）时与FSH含量呈极显著相关（P＜0.01）。TRH含量始终与FSH、hCG、GnRH含量呈极显著相关（P＜0.01），且与其他激素升降趋势一致，TRH含量在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期与LH含量呈极显著相关（P＜0.01），但是排卵后TRH与LH含量的相关性不显著。

以上结果提示，在马的繁殖季节，可以每天采血进行生殖激素监测，追踪FSH、LH、hCG含量变化，当它们含量逐渐上升后，突然开始下降时，为最佳输精时间。