籽鹅精子品质及不同冷冻稀释液保存效果测定

许红喜，刘胜军，张 震，刘国君

（1.黑龙江省农垦科学院 畜牧兽医研究所，哈尔滨 150038；2.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319；3.黑龙江省农业科学院 畜牧研究所，哈尔滨 150086）

随着全国范围内鹅业的大发展，黑龙江省先后引入了霍尔多巴吉、四川白鹅、皖西白鹅、狮头鹅、浙东白鹅及大三花等知名鹅品种加以利用，这为黑龙江省发展鹅业生产提供了充足的种源保障［1］。黑龙江省本土看家品种籽鹅适应性强，产蛋性能高，能在寒冷的气候环境、粗劣的饲养管理条件下保持高产，是世界上罕见的高产鹅种［2］。但是与引进的快大型肉鹅相比体型小、生长速度慢，有逐渐被广大养殖户淘汰的趋势［3］，保种育种成为当前黑龙江省鹅养殖研究中的重点［4］。鹅精液冷冻技术是一种有效的保种方法，使人工输精技术不再受时间和空间的限制，对促进鹅精液采集和人工输精技术的发展起到至关重要的作用。家禽精液冷冻技术正致力于濒危禽类精子冷冻保存基因库的建立，在欧洲濒危物种计划（EEP）中冷冻保存了17种濒危鸡形目的精液［5］。鹅精液采集和冷藏冷冻技术，特别是精液冷冻后用于人工输精方面还没有真正应用于生产。鹅与鸡、鸭等其他家禽相比个体大、饲养成本高，自然交配公母比率低（1∶4左右），精液品质、产蛋、受精率和孵化率都较低，尤其到了繁殖后期精液品质、交配频率和受精率又急剧降低，因此，在产蛋不同时期进行种鹅精液筛查的同时研究冷冻技术是非常必要的。如果禽精液冷冻技术能成熟应用到生产实践中，对引种保种、改良本地品种、节约成本、增加养殖户的经济效益意义重大。本研究进行了哈尔滨地区4—6月份自然状况下籽鹅精子品质、冷藏和冷冻后精子活力测定，为后续进行籽鹅人工授精奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物

2018年4月1日，在哈尔滨牧娃鹅业种鹅场，选取健壮活泼、阴茎发育良好的2岁纯种籽鹅种公鹅20只，单独饲养，饲养管理方式与大群种鹅相同。

1.2 试剂与仪器

主要试剂包括L-谷氨酸钠（G8010，Solarbio®公司产品）、无水磷酸氢二钠（D7290，Solarbio®公司产品）、无水磷酸二氢钠（Solarbio®公司产品）、无水葡萄糖（Solarbio®公司产品）、聚乙烯吡咯烷酮（Solarbio®公司产品）、硫酸鱼精蛋白（Solarbio®公司产品）、肌醇（Solarbio®公司产品）、二甲基乙酰胺DMA（Solarbio®公司产品）、无水醋酸镁（Solarbio®公司产品）、无水醋酸钾（Solarbio®公司产品）、二甲基甲酰胺（DMF，Solarbio®公司产品）、Tris（Sigma公司产品）。

主要仪器包括天子天平（雷磁公司产品）、渗透压仪（雷磁公司产品）、显微镜（奥林巴斯产品）；血细胞计数板、pH计（雷磁公司产品）、禽专用集精杯、0.25 mL微型冻精细管，以上仪器均来源于黑龙江省农垦科学院畜牧兽医研究所实验室。

1.3 冷冻稀释液配方

配方1：柠檬酸钾0.14 g，谷氨酸钠1.40 g，磷酸氢二钠0.98 g，磷酸二氢钠0.21 g，葡萄糖0.70 g，果糖0.20 g，肌醇0.70 g，聚乙烯吡咯烷酮0.10 g，硫酸鱼精蛋白0.02 g，水100 mL，渗透压390 mOsm/kg，pH值7.3［6］。

配方2：谷氨酸钠1.92 g，葡萄糖0.80 g，无水醋酸镁0.08 g，无水醋酸钾0.50 g，聚乙烯吡咯烷酮0.30 g，水100 mL，渗透压343 mOsm/kg，pH值7.08［7］。

配方3：Tris-柠檬酸稀释液：三羟甲基氨基甲烷24.224 g，柠檬酸13.536 g，葡萄糖11 g，甘油60 mL，大豆植物蛋白2 g，水1 000 mL［8-9］。

1.4 籽鹅精液的采集

每周进行一次采精，在周一早上08：00—09：00，早晨控水控料，采用背腹式按摩采精法［10］采集20只籽鹅精液。背腹式按摩法采精应由3人操做。先把鹅放在采精架上，一位助手按住鹅的翅膀根部（也可以把鹅保定），另一位助手左手持集精杯，右手用灭菌生理盐水浸过的棉球由中央到外周擦洗泄殖腔。采精人员左手五指分开，掌心向下从公鹅翅膀根部向尾部方向有节奏地按摩，每次1～2 s，持续 四五次后左手按摩，捎带挤压公鹅尾根部，同时右手拇指和食指有节奏地按摩腹部后面的柔软部，并逐渐挤压按摩泄殖腔环，使其充血引起阴茎勃起，此时左手拇指和食指轻挤泄殖腔环背侧，精液沿输精沟从阴茎顶端射出。另一位立即用预先消毒好的集精杯收集精液、需要注意鹅每次所出精液量很少，必须小心收集，勿流于集精杯外，整个采精过程需要120 s左右。

1.5 冷藏试验和冷冻试验

选择优良籽鹅的精液，用配方1，2，3稀释液做1∶1稀释后分成2份，放到有冰袋的保温盒中尽快带到实验室。在实验室将2份样品中的1份放到4℃冷藏柜进行冷藏试验，另1份进行冷冻试验，每份都设9个重复样品，间隔24 h观察精子活力。

将冻精细管和冷冻保护剂DMF提前放到4℃冷藏柜中预冷，将冷冻试验的精液在4℃冷藏柜中平衡30 min，在标有配方1，2的样品中加入冷冻保护剂DMF，终浓度为6%，平衡15 min［11］。用注射器装管，平衡30min，平铺在液氮面上熏蒸，熏蒸距离液氮面的高度为2 cm，大约-120℃平衡8 min［13］，投入液氮中。用镊子在液氮中取出细管冻精，40℃水浴1 min，观察精子活力，间隔24 h观察，测定。

1.6 测定项目

采用A.Jerysz等［12］的方法对按摩法采精性反应程度进行分类评分。1型为优秀，反应快速少于60 s，射精快；2型为良好，反应较慢，多于60 s，射精较慢；3型为差，对按摩有反应，反应速度特别慢，不射精；4型为最差，对按摩根本没反应。本试验中选取健壮和阴茎发育良好的种公鹅20只，经评定，全部为1型。用离心管分别收集公鹅精液，备用。在4—6月份期间，每周一采集种鹅精液，测定精液品质，包括射精量、精子密度、精子活力。取当月4次平均值作为该月数据。

鹅精液体积在禽专用集精杯上直接读取数据；精子活力在显微镜下观察评估5个视野，记录数据；精液密度使用3%NaCl溶液将原精稀释100倍，在血细胞计数板数出5个中格总精子数，多次测量，取平均数。

1.7 数据的统计分析

试验数据采用SPSS软件中的ANOVA程序进行检验，后进行LSD统计。

2 结果与分析

2.1 籽鹅不同时间精液品质

采用背腹式按摩法采精需要用禽专用集精杯收集籽鹅精液。结果可见，精液外观颜色呈乳白色，无杂质，射精量、精子密度和精子活力结果见表1。其中4，5，6月份射精量分别为0.374，0.310，0.229 mL，精子密度为5.600，4.700，4.089亿个/mL，精子活力为0.806，0.743，0.675，随着时间的推移，射精量、精子密度、精子活力都在逐渐下降。

表1 4，5，6月份籽鹅精液品质测定结果

2.2 冷藏试验

3种配方稀释的籽鹅精液保存在4℃冷藏，间隔24 h在显微镜下观察、记录数据，结果见表2。其中保存0 h精子活力在3个配方之间差异不显著（P＞0.05），保存24 h精子活力在3个配方之间差异显著（P＜0.05），保存48，72 h精子活力在3个配方之间差异极显著（P＜0.01）。总的来说，随着时间的推移，精子活力呈下降趋势，配方3的精子活力在各时间点都是最高的。

表2 4℃冷藏籽鹅精液解冻后采用不同稀释液存放不同时间的精子活力测定结果

2.3 冷冻试验

3种配方稀释的籽鹅精液经冷冻程序冷冻保存在液氮中，细管冻精在40℃水浴中1 min，水平放置剪开两端，倒入0.5mL离心管，放在4℃冷藏保存，间隔24 h观察精子活力，结果见表3。其中保存0，24，48 h精子活力在3个配方之间差异不显著（P＞0.05），保存72 h精子活力在3个配方之间差异极显著（P＜0.01）。总的来说，随着时间的推移，精子活力呈下降趋势，配方3的精子活力在各时间点都是最高的。

表3 超低温冷冻保存籽鹅精液解冻后采用不同稀释液存放不同时间的精子活力测定结果

3 讨论

3.1 籽鹅不同时间精液品质比较

籽鹅射精量范围为0.1～0.8 mL，4，5，6月份射精量平均是0.37，0.31，0.23 mL，精子密度为5.600，4.700，4.089亿个/mL，精子活力为0.806，0.743，0.675。黑龙江省产蛋高峰在4，5月份，在产蛋后期6月份射精量、精子密度和精子活力显著下降，可通过严格的饲养管理使种鹅保持良好的繁殖性能。狮头鹅饲养管理饲料能量水平应达到11.1 MJ/kg，粗蛋白达14%以上，钙、磷分别为1.2%和0.6%。公鹅对 维生素A、维生素D和 维生素E的需要量比母鹅多，饲料中维生素E浓度达到每吨饲料40～50 g时，可显著提高受精率［14］。产蛋后期有必要进行精液品质评定，淘汰评定为差和最差的种公鹅，有利于提高种蛋受精、出雏率及种群繁殖力。

3.2 关于冷藏试验

配方1，2，3稀释液冷藏鹅鲜精试验是在种鹅场采精观察完稀释，放在冰盒中带到实验室，这个过程经历了大约6 h。在实验室开始计时采用3种配方的稀释液保存于4℃，结果表明，0 h精子活力分别为0.797，0.798，0.803；4℃冷藏第3天（即72 h）活力分别为0.085，0.233，0.388。林祯平等［15］将狮头鹅精液1∶1稀释后进行人工输精，种蛋受精率最高，为90%。精液需要达到一定的有效精子数才能维持较高的种蛋受精率，每次输入的有效精子数需在0.19亿个以上效果较好［15］。因此在生产实践中，随着保存时间的延长精子活力降低，应增加输精体积，保持有效精子数在0.19亿以上。低温Tris-柠檬酸大豆植物蛋白冷藏稀释液（配方3）保存精子到第3天，也与配方1，2一样，精子活力急剧下降。综合来看，如果是现采现用，3种稀释液配方都可用，如果是异地输精选择配方3效果较好。

3.3 关于冷冻试验

超低温液氮冷冻鹅精子解冻后，配方1，2是国外应用广泛的Lake’s和EK液，冻后0 h精子活力达0.243和0.297，低于配方3（0.360）。精子在低温状态下细胞膜的通透性发生改变，顶体受到损伤，从而出现冷休克。配方3是Tris-柠檬酸稀释液，含有大豆植物蛋白，在低温下起到保护精子作用。这个配方未采用传统的卵黄、牛奶等动物性保护剂，传统稀释液卵黄、奶粉或鲜奶等冷冻保护剂在精液冷冻保存中可以起到较好的抗冻作用，这些冷冻保护剂有效成分是低密度脂蛋白（LDL）；但是世界动物健康组织（OIE）早在2003年建议，精液处理中应该避免使用有生物学感染风险的动物源产品［16］。家禽精液冷冻是家禽人工授精和物种基因库保存的基础，但目前仍然没有一套系统有效的冷冻方法能够使家禽冷冻精液达到较好而稳定的受精率［17］。3种稀释液效果比较，配方3无论冷藏试验还是冷冻试验保存籽鹅精液效果都是最好的。由此，本试验通过借鉴国外及其他家畜精液冷藏、冷冻保存方法技术，初步建立籽鹅精液冷冻程序，为下一步鹅人工输精改良本地品种打下良好基础。

4 结语

籽鹅是黑龙江省看家鹅品种，很多试验表明籽鹅精液品质优于其他外来品种如莱茵鹅和豁眼鹅等［18-20］。本试验中，射精量、精子密度及精子活力这些指标到产蛋后期都显著降低，需要加强饲养管理，提高种蛋受精率；在冷藏试验和冷冻试验保存籽鹅精液都是配方3最好。该方法的建立为下一步鹅人工输精改良本地品种打下良好基础。