应用微生物技术筛选荧光增白浆液杀菌防腐剂

周开丰，宁 静，赵超越，吴越超

（奥仕集团有限公司，浙江 江山 324123）

荧光增白浆液其荧光增白剂本身和所使用环境友好型表面活性剂能被微生物降解，以及生产过程的开放性，使其在贮存过程中极容易腐败变质[1]。浆液的腐败变质，可能会导致发臭、pH变化、产生气体、改变黏度、凝聚沉淀、染料变色等物理、化学变化，从而影响产品的质量和应用。

添加杀菌防腐剂是解决浆液腐败变质的经济有效方法，但杀菌防腐剂的品种繁多，每种杀菌防腐剂都有不同的杀菌机理和适合条件，如何筛选适用的、有效的杀菌防腐剂一直是行业内让人头痛的问题。有人曾对一种防腐剂进行过现场筛选，其方法是配制一个包装（50 kg）的样品，放置2个月后，打开检查发现浆液没有发臭，就认为此防腐剂效果好，于是就将其投入生产，结果出现大面积的变质发臭产品，给企业造成不小的经济损失。

本研究使用微生物技术，以腐败变质的浆液作测试菌源，利用少量的样品同时做多种杀菌防腐剂、不同含量的杀菌防腐效果比较，以提高了筛选范围和效率，使所筛选出的杀菌防腐剂具有高度的针对性。

1 实验部分

1.1 试剂与原料

营养琼脂培养基；红四氮唑（TTC），分析纯；无菌水，自制；无防腐剂荧光增白浆液，质量分数16%组合物，自制；测试菌种，含量3.58×109CFU/mL，自制。

杀菌防腐剂共19个样品，分别由6个厂家生产，其概况见表1。

表1 19种杀菌防腐剂概况Tab 1 Overview of 19 kinds of antiseptics

1.2 仪器和设备

ф90 mm培养皿，培养皿灭菌筒，1 mL吸管，10 mL吸液管。100～500μL微量进样器。

电热鼓风干燥箱，101型；水套式恒温培养箱，GHP-9160；高压灭菌锅，Systec V-75；菌落计数器，J-2；激光粒度分布仪，BT-9300ST；水平超净工作台，HS1300；数显恒温水浴锅HH-4。

1.3 准备实验

1.3.1 材料、器皿灭菌

培养皿、吸管150℃干燥灭菌150 min备用；营养琼脂培养基、质量分数1%的TTC溶液121℃高压灭菌15 min备用；微量进样器、去离子水121℃高压灭菌30 min备用。

1.3.2 测试菌种制备

从3个已腐败变质的浆液产品中各取5 mL，装入100 mL干净的塑料瓶中，拧紧盖子，充分摇匀，用菌落总数测定方法对其含菌量进行检测[2]。经检测含菌量为3.58×109CFU/mL。然后加71.7 mL无菌水，拧紧盖子，充分摇匀，即得含菌量6.19×108CFU/mL）测试菌种，放入5℃冰箱保存备用。

1.3.3 无防腐剂荧光增白浆液制备

从车间取研磨浆液合格不加防腐剂的质量分数20%的浆液7.5 L，用去离子水稀释成质量分数10%15 L，用干净的塑料壶盛装，拧紧盖子放入5℃冰箱保存备用。

1.4 细菌培养温度的确定

将无防腐剂荧光增白浆液装入10个干净的100 mL的塑料瓶中，两两一组分别放在10、20、30、36、45℃下配养1周，然后进行感官和微生物检查。

1.5 杀菌防腐剂的筛选

1.5.1 第1次筛选

1）加入杀菌防腐剂。将无防腐剂的浆液分装到58个50 mL干净的塑料瓶中，每瓶50 mL，然后用100μL的微量进样器加入杀菌防腐剂，每种杀菌防腐剂做3个使用质量分数0.05%、0.10%、0.20%的样品，充分摇匀，同时做1个不加杀菌防腐剂的对照样，共有58个样。注意：每加完一种杀菌防腐剂后，应将微量进样器彻底清洗干净后再用或更换微量进样器，防止杀菌防腐剂相互影响。

2）接种。在每个样品用0.5 mL进样器加入0.1mL测试菌种（6.19×108CFU/mL），充分摇匀，使样品中的菌的浓度达到106CFU/mL。

3）培养。将样品放置在(30±1)℃的培养箱中培养1周。

4）杀菌防腐效果的测定。样品培养1周后，摇匀的样品。无菌操作先在无菌培养皿中加入1 mL无菌水，用1 mL无菌吸管加1滴（约30 mg）样品（1个样1支吸管），要滴在无菌水，马上转动菌培养皿使样品在水中分散开，然后用熔化冷却到45℃加有TTC的无菌营养琼脂培养基倒平板[3]。每个样做2个平行样，同时倒2个只加无菌水不加样品的平板作空白样。然后放入(30±1)℃的培养箱中培养1周，用菌落计数器计数每个平板中的菌落数。

1.5.2 重复筛选

为了保证筛选的可靠性和检验其长效杀菌防腐性能，对初步筛选出的样品再进行重复筛选，将它们按1.5.1节中所述的步骤做重复筛选。

1.6 实际使用效果

对重复筛选得到的实际使用效果进行验证，从2020年9月至2021年3月分别将WL-20、BRCPLUS、CP-A样品用于生产，每个样品连续使用2～3个月，对其使用期间的生产设施（贮槽、管道等）和产品中的细菌生长繁殖情况进行检测，并与2020年9月前对生产设施（贮槽、管道等）和产品中的细菌生长繁殖情况检测结果进行对比。

2 结果与讨论

2.1 细菌培养温度

浆液中细菌在不同温度下的生长繁殖情况见表2。

表2 浆液中细菌在不同温度下的生长繁殖Tab.2 The growth and reproduction of bacteria in the slurry at different temperature

由表2可知，温度在20～36℃时比较适合浆液中细菌生长，说明污染浆液的细菌以中温型细菌为主，所以杀菌防腐剂筛选时细菌培养温度选在30℃。

2.2 第1次筛选

杀菌防腐剂主要是通过杀死微生物或使其失去生长繁殖能力来实现物料在使用工程中不发生腐败变质，其作用机理十分复杂。一般认为，杀菌防腐剂可使微生物中的蛋白质变性，降低细胞的活性促使细菌死亡，也可使微生物的细胞遗传基因发生变异或干扰细胞内部酶的活性使其难以生长繁殖[4]。由于杀菌防腐剂作用机理是十分复杂，所以其各有各的特点。

第1次筛选菌落计数结果见表3。

表3 第1次筛选菌落计数结果Tab 3 The first screening colony count result

各种防腐剂都有一定的作用范围[5]。由表3可知，19种杀菌防腐剂对浆液中细菌的作用效果是不同的，有的（如SCJ-2008）在质量分数0.2%下几乎不起作用；有的（如BB等）在质量分数0.2%下有作用，但作用不彻底；还有的（如SCJ-980）在质量分数0.05%下就能彻底控制浆液中细菌的生长繁殖。19种杀菌防腐剂中在质量分数0.2%下不能彻底控制浆液中细菌生长繁殖的有11种，只占总数的58%，通过筛选一下就将一半多不适用的样品淘汰出局，同时获得适用样品的适宜的使用含量，克服了浆液杀菌防腐剂在使用上（品种和用量）的盲目性。

这样第1次筛选，初步选WL-20、SCJ-955、SCJ-875、SCJ-980、MBS-5050、BRC-PLUS、BRC-H、CP-A等8个对浆液杀菌防腐效果较好的样品，但MBS-5050、SCJ-875、SCJ-980是阳离子型的，暂不考虑选用，故只剩下WL-20、SCJ-955、BRC-PLUS、BRC-H、CP-A这5个样品。

2.3 重复筛选

重复筛选结果见表4。

表4 重复筛选菌落计数结果Tab 4 Repeated screening of colony count results

从表4可知，5个样品经过第2次筛选后有2个样品的杀菌防腐性能有所下降，在质量分数0.2%下不能彻底控制浆液中细菌生长繁殖，说明其长效杀菌防腐性能较差，如果其被使用于浆液，在较长的保质期内存在产品被污染的风险，所以应将它们淘汰出局。通过重复筛选得到WL-20、BRC-PLUS、CP-A这3个具有长效杀菌防腐性能的荧光增白浆液杀菌防腐剂。

2.4 生产验证

分别将WL-20、BRC-PLUS、CP-A用于生产，结果见表5；2020年9月前生产设施和产品中的细菌生长繁殖情况见表6和表7。

由表5可知，杀菌防腐剂WL-20、BRCPLUS、CP-A用于生产后，生产设施（贮槽、管道等）和产品中的都没有检测到细菌生长繁殖，也没有因产品腐败变质而被投诉。

表5 3种杀菌防腐剂的实际应用效果Tab 5 Practical application effects of 3 kinds of antiseptics

由表6和表7可知，在替换防腐剂前所生产的产品中有27%批次的产品不同程度受到细菌污染，生产设施也存在不同程度的细菌污染，并因产品腐败变质受到客户投诉3次（2个月）。

表6 以前317个产品留样感官和微生物Tab 6 Sensory and microbiological samples of the previous 317 products

表7 以前生产体系中管道、贮罐微生物Tab 7 Microorganisms in pipelines and storage tanks in previous production systems

通过对比，证明用腐败变质的浆液作测试菌源所筛选出的杀菌防腐剂WL-20、BRC-PLUS、CP-A完全能控制浆液生产设施和产品中的细菌生长繁殖。

3结论

提出的使用已经变质的荧光增白浆液作为污染细菌源，通过微生物技术针对性地筛选可以抑制荧光增白浆液特定细菌生长的杀菌防腐剂。在1个月的时间内从19种杀菌防腐剂中筛选出3种适合荧光增白浆液使用的杀菌防腐剂，筛选效率高。经过7个月1 258批次生产实际使用验证，产品100%无豆腐脑状沉淀、100%不发臭、100%无细菌生长繁殖，生产设施100%没有检测到细菌生长繁殖现象。结果表明，所筛选的3个杀菌防腐剂都能完全控制生产设施和产品中微生物的生长繁殖，提高了产品质量。所以本筛选方法可快速、稳定地对大量杀菌防腐剂样品进行筛选，效率高、效果显著，结果可靠，实用性强。

本方法对其它产品体系杀菌防腐剂的筛选具有一定的参考作用。