山楂叶总黄酮对心肌缺血再灌注大鼠心肌线粒体呼吸功能的影响

张 振，刘 婵，王国龙，王 猛

通过药物溶栓或经皮冠状动脉介入治疗急性心肌梗死使血流再通是临床抢救病人的关键，心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)损伤严重影响病人预后[1]。线粒体是心肌细胞重要的细胞器，通过呼吸链实现能量代谢释放三磷酸腺苷(ATP)是基本功能，线粒体功能障碍是导致心肌细胞损伤、加重MIR损伤的重要病理机制[2]。山楂叶总黄酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是从山楂树叶子中提取的黄酮类化合物，通过抑制氧化应激和细胞凋亡对心肌缺血再灌注大鼠发挥一定的保护作用[3-4]。本研究通过夹闭左冠状动脉前降支30 min方法制备MIR大鼠模型，探讨HLF对MIR后心肌细胞线粒体功能的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠100只，7周龄，210～240 g，购自河北省实验动物中心[SCXK(冀)2018-004]；实验前适应性饲养1周，环境设置：室温(25±1)℃、相对湿度(60±5)%、明暗12 h交替，实验前12 h禁食不禁水。

1.2 实验药物与试剂 HLF购自山西晋城中晋药业有限公司(总黄酮含量≥95%)；还原型辅酶Ⅱ(NADH)脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和ATP含量检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；膜电位(△ψm)、膜通透性转换孔(MPTP)开放度检测试剂盒和Jc-1荧光探针均购自北京博奥森生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 DW-2000型动物呼吸机(上海嘉鹏技术有限公司)，BL-A420型动物心电图机(上海精密科学仪器有限公司)，MTP-601F型荧光酶标仪(日本 Corona公司)，TJ-6 Centrifuge型低温离心机(美国Beckman公司)，UV-1200型紫外-可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，H-7650型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、给药与模型制备 将100只大鼠进行数字编码，按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、MIR组、HLF 25 mg/kg组、HLF 50 mg/kg组、HLF 100 mg/kg组[5]，各20只。各组大鼠于造模前10 min腹腔注射给药，Sham组和MIR组腹腔注射生理盐水。参照王平安等[6]方法制备MIR大鼠模型，实验过程实施二联心电图实时监测；造模结局判断：夹闭左冠状动脉前降支后左心室心肌苍白、发绀，心电图示ST段弓背持续抬高或T波高耸，30 min后松开动脉夹实现血流再灌注后ST段抬高或T波降低，判定为造模成功；假手术组不夹闭冠状动脉前降支，其余操作同MIR组。再灌注2 h后取材并进行各项指标检测。

1.4.2 线粒体制备 参考文献[7]，每组随机取10只大鼠，经颈椎脱臼处死后开胸取心脏，于冰上剪取左心室心肌，称重后加入9倍4 ℃冷裂解液(Tris 0.303 g，蔗糖42.79 g，EGTA 0.186 g，定容于500 mL，调节pH值为7.4)，制备浓度10%的左心室心肌组织匀浆液，4 ℃条件下，以1 000 r/min离心10 min，取上清液；4 ℃条件下，以15 000 r/min离心15 min，取沉淀，即为线粒体。采用Lowry法检测线粒体蛋白表达。

1.4.3 线粒体呼吸功能指标和呼吸酶活性检测 采用Clark氧电极法检测态3呼吸(R3)、态4呼吸(R4)、呼吸控制率(RCR)，取1 mg蛋白量线粒体加入2.5 mL反应介质中30 ℃恒温孵育1 min，加入20 μL显色底物，2 min后加入10 μL二磷酸腺苷，连续耗氧曲线即为R3，二磷酸腺苷完全磷酸化后耗氧曲线为R4，R3、R4耗氧速率比值为RCR。按照试剂盒操作说明，通过紫外-可见分光光度计检测线粒体NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性。

1.4.4 线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+浓度检测 取1 mg蛋白量线粒体采用超声波破碎，之后参照试剂盒操作说明，通过紫外-可见分光光度计检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性；以CaCO3为标准，通过原子化学发光法检测游离Ca2+浓度。

1.4.5 线粒体超微结构观察 每组取剩余10只大鼠，颈椎脱臼处死后取左心室，切割成5 mm3组织块，在4 ℃条件下，置入4%戊二醛溶液中固定24 h、4 ℃的1%锇酸固定3 h后，梯度乙醇和无水丙酮脱水、氧化丙烯置换、Epon812环氧树脂浸透包埋，70 nm厚度超薄切片后通过醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重电子染色，采用透射电子显微镜观察细胞线粒体超微结构。

1.4.6 线粒体△ψm、MPTP开放度检测 取1 mg蛋白量线粒体，按照△ψm检测试剂盒操作说明处理后，采用JC-1荧光探针，通过荧光酶标仪检测(激发波长485 nm，发射波长590 nm)，荧光值越高提示△ψm表达越高。取1 mg蛋白量线粒体，按照MPTP开放度检测试剂盒操作说明处理后，通过荧光酶标仪检测(激发波长540 nm，发射波长580 nm)，荧光值越高提示MPTP开放度越高。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌线粒体呼吸功能指标比较 与Sham组比较，MIR组线粒体呼吸功能指标R3、RCR降低(P<0.01)，R4升高(P<0.01)；与MIR组比较，HLF 50 mg/kg组、HLF 100 mg/kg组R3、RCR升高(P<0.01)，R4降低(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌线粒体呼吸功能指标变化(±s)

2.2 各组大鼠心肌线粒体呼吸酶活性和ATP含量比较 与Sham组比较，MIR组线粒体NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性和ATP含量降低(P<0.01)；与MIR组比较，HLF 50 mg/kg组、HLF 100 mg/kg组NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性和ATP含量升高(P<0.05或P<0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌线粒体呼吸酶活性和ATP含量比较(±s)

2.3 各组大鼠心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+浓度比较 与Sham组比较，MIR组线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性降低(P<0.01)，Ca2+浓度升高(P<0.01)；与MIR组比较，HLF 50 mg/kg组、HLF 100 mg/kg组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性升高，Ca2+浓度降低，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+浓度比较(±s)

2.4 各组大鼠心肌线粒体超微结构图像 Sham组大鼠心肌线粒体超微结构未见异常；MIR组心肌线粒体排列紊乱、变性肿胀、数量减少、膜破裂、线粒体嵴结构模糊、断裂溶解等超微结构病变；与MIR组比较，HLF各剂量组心肌线粒体超微机构呈不同程度减轻，其中HLF 100 mg/kg组线粒体膜较完整、嵴结构较清楚。详见图1。

图1 各组大鼠心肌线粒体超微结构图像(×104)(A为Sham组；B为MIR组；C为HLF 25 mg/kg组；D为HLF 50 mg/kg组；E为HLF 100 mg/kg组)

2.5 各组大鼠心肌线粒体△ψm、MPTP开放度比较 与Sham组比较，MIR组心肌线粒体△ψm降低(P<0.01)，MPTP开放度升高(P<0.01)；与MIR组比较，HLF 50 mg/kg组、HLF 100 mg/kg组心肌线粒体△ψm升高(P<0.01)，MPTP开放度降低(P<0.01)。详见表4。

表4 各组大鼠心肌线粒体△ψm、MPTP开放度比较(±s，RFU)

3 讨 论

心血管疾病发病率居我国居民疾病谱首位，其中急性心肌梗死具有起病急、进展快、致死率高的特点，通过药物或手术及时实现血管再通是挽救急性心肌梗死病人生命的关键，但MIR损伤严重影响病人预后。线粒体约占心肌细胞体积的1/3，是心肌细胞重要的细胞器，线粒体受损导致心肌细胞凋亡、自噬及坏死[8-9]，Prokudina等[10]研究发现，线粒体功能障碍在MIR损伤疾病进展中发挥着重要作用。

近年来，随着国家振兴中医药战略的实施，中医药治疗心血管疾病逐渐得到关注与认可。山楂叶为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥叶，是我国传统中药品种，味酸、性平，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效，临床用于气滞血瘀、胸痹心痛、胸闷憋气、心悸健忘等症治疗。HLF是山楂叶的主要活性物质，包含槲皮素、芦丁、牡荆素等成分，具有良好的抗氧化活性[11]。徐颖等[12]研究发现，HLF对肥大心肌细胞线粒体具有保护作用。本研究结果显示，HLF治疗后，能有效提高MIR大鼠缺血区心肌线粒体R3、RCR并降低R4，改善NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性并提高ATP含量，提示HLF具有改善MIR大鼠心肌线粒体呼吸功能，提高能量代谢能力的作用。

线粒体功能障碍导致ATP合成受阻，进而影响ATP依赖性酶活力。其中Na+-K+-ATP酶活力降低导致线粒体膜Na+/K+交换受阻，引发Na+/Ca2+交换，使Ca2+大量进入线粒体，Ca2+-ATP酶活力降低，进而引起线粒体Ca2+超载[13]。过量Ca2+对呼吸链氧化磷酸化过程具有抑制作用，加重线粒体呼吸功能障碍，形成恶性循环从而加重MIR损伤。线粒体△ψm是线粒体膜内外电位差，具有重要的生理功能，Alizadeh等[14]研究显示，△ψm降低导致ATP合成受阻。线粒体MPTP开放度对维持线粒体离子平衡至关重要，线粒体受损导致MPTP开放度升高而使△ψm下降、细胞色素C释放等进而加重线粒体损伤[15]。本研究结果显示，HLF治疗后能改善MIR大鼠缺血区心肌线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力，降低Ca2+含量，改善线粒体变性肿胀、数量减少、膜破裂、线粒体嵴结构破坏等超微结构病变，提高△ψm并降低MPTP开放度，提示HLF对MIR大鼠缺血区心肌线粒体功能的保护作用可能与抑制线粒体Ca2+超载、保护线粒体△ψm和MPTP开放度及抑制线粒体超微结构病变有关。

综上所述，HLF对MIR大鼠心肌线粒体呼吸功能具有保护作用，其机制可能与抑制线粒体Ca2+超载、维持线粒体膜稳定性有关。