伊伐布雷定对病毒性心肌炎大鼠Bcl-2基因启动子区甲基化及mRNA表达的影响

陈小霞，程齐尧，詹 磊，蒋 磊

心肌炎是心肌局限性、弥漫性的急性、慢性炎性病变，可由多种因素诱导发病，分为非感染性心肌炎和感染性心肌炎，病毒感染是常见的病因，其次是细菌、真菌、病原体等[1]。病毒性心肌炎是指病毒侵犯心肌组织引起急性、慢性心肌炎性病变，其中柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是诱发病毒性心肌炎的常见病毒，占30%～50%，病毒侵犯对心肌组织造成直接损伤，引起心肌细胞变性和坏死，影响心肌组织功能[2]。病毒性心肌炎目前尚无特异性治疗方案，主要采取对症治疗，包括抗病毒治疗、免疫治疗、强心和利尿治疗等，以减轻心脏负荷为治疗原则[3]。临床常用的β-受体阻滞剂可帮助病毒性心肌炎病人减慢心率，以达到改善病毒性心肌炎病人预后，但β-受体阻滞剂可产生负性肌力作用和抑制传导系统，使用过程中可能加重病人心功能损伤[4]。伊伐布雷定属于选择性、特异性窦房结If通道阻滞剂，降低心律同时不影响心肌收缩力和心脏的传导能力，2015年已在我国获批上市用于心力衰竭的治疗[5]。相关研究表明，伊伐布雷定在冠心病[6]、心力衰竭[7]、心绞痛[8]等疾病中表现出心脏保护作用，有研究表明，伊伐布雷定治疗病毒性心肌炎患儿的临床疗效显著[9]，但伊伐布雷定治疗病毒性心肌炎的作用机制尚未明确。本研究通过制备病毒性心肌炎大鼠模型探讨伊伐布雷定对病毒性心肌炎作用机制，以期为临床治疗病毒性心肌炎提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠75只，体质量(160±10)g，购自广州中医药大学[SCXK(粤)2019-0047]，购回后于SPF级环境饲养，饲养室温度20～25 ℃，湿度50%～55%，昼/夜各12 h，全天自由饮水、进食。本实验通过我院动物伦理委员会批准，遵守“3R”原则。

1.2 实验试剂及仪器

1.2.1 实验试剂 CVB3(武汉大学病毒研究所)，伊伐布雷定(YJ-26039R，上海雅吉生物科技有限公司)，肌红蛋白(Mb)试剂盒(0-027530，上海江莱生物科技有限公司)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(QY-BM11392，上海乔羽生物科技有限公司)，心肌肌钙蛋白I(cTnI)试剂盒(BS-E12272R1，广州徕智生物科技有限公司)，乳酸脱氢酶(lactate dehydro-genase，LDH)活力检测试剂盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，RNAprep pure细胞试剂盒与Reverse Transcriptase Kit(天根生化科技北京有限公司)，2×HSYBR qPCR Mix(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)，动物组织DNA抽提纯化试剂盒(104-201，南京莱富赛生物科技有限公司)，EZ DNA Methylation-GoldTMKit(D5005，上海复申生物科技有限公司)，Go Taq Green Master Mix(M7122，南京赛泓瑞生物科技有限公司)。

1.2.2 实验仪器 SelectspinTM17R冷冻离心机(美国Select BioProducts公司)，ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析仪(美国Bio-rad公司)，LightCycler®96实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(罗氏诊断产品上海有限公司)。

1.3 制备病毒性心肌炎大鼠模型 将75只SD大鼠随机均分为对照组、模型组、伊伐布雷定低剂量组、伊伐布雷定中剂量组、伊伐布雷定高剂量组，参考文献[10]制备病毒性心肌炎大鼠模型，模型组和伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠腹腔注射0.1 mL 100 TCID 50与0.1 mL CVB3稀释液，对照组注射等体积磷酸盐缓冲液，连续注射3 d。

1.4 药物干预 首次注射CVB3后24 h，根据伊伐布雷定临床用药剂量(每日5～14 mg)、成人与大鼠药物用量折算系数(6.25)设置伊伐布雷定剂量4 mg/kg、8 mg/kg、12 mg/kg分别作为伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组干预剂量，采取灌胃方式，每日1次，对照组和模型组灌胃等体积磷酸盐缓冲液，连续干预2周。末次给药24 h后，股动脉取血进行心肌损伤标志物水平检测，取部分心脏组织用于苏木精-伊红(HE)染色，观察心肌病理结构变化和脱氧核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡指数，余下心脏组织用于实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测。

1.5 观察指标

1.5.1 心肌损伤标志物检测 随机选取6只大鼠，取股动脉血5 mL，以3 000 r/min离心15 min，取上清液储存于-80 ℃，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测CK-MB、Mb、cTnI、LDH水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.2 HE染色检测心肌组织病理情况 每组随机选取6只大鼠，取心脏组织固定于10%甲醛中性溶液，常规石蜡包埋、切片(5 μm)、脱蜡、水化、HE染色、脱水、透明、中性树胶封片后在高倍镜下(400倍)观察大鼠心肌组织病理学变化。

1.5.3 TUNEL检测心肌组织凋亡情况 常规石蜡包埋、切片至水化操作同1.5.2，采用蛋白酶K修复20 min，3% H2O2室温封闭5 min，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)于37 ℃条件下反应1 h，氧化物酶标记的链霉卵白素工作溶液反应30 min、0.05%二氨基联苯胺(DAB)显色4 min、苏木精复染10 min、脱水、透明、封片，显微镜下采集图像。细胞核表现为棕黄色或棕褐色颗粒是凋亡阳性细胞，在高倍镜下(400倍)随机选取5个不重叠视野，记录视野中细胞总数和凋亡阳性细胞数量，计算细胞凋亡指数，细胞凋亡指数=凋亡阳性细胞数量/细胞总数×100%。

1.5.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因mRNA表达水平 通过RNAprep pure细胞试剂盒提取心肌组织总RNA，Reverse Transcriptase Kit逆转录生成第一条cDNA链用于实时荧光定量PCR扩增，以U6作为内参基因，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、40个循环，62 ℃ 1 min。收集荧光阈值循环数(Ct)值输出，采用2-△△Ct公式计算Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相对表达量，再进行数据的统计学分析。Bcl-2：正向引物5′-TGAACCGGCATCTGCACAC-3′，反向引物5′-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3′；Bax：正向引物5′-CAGTTGAACTTCCCATCAGC-3′，反向引物5′-CAGTTCAAGTTC CCATCAGC-3′；CytC：正向引物5′-TGATCCTTTGTCGTGTTGACCAG-3′，反向引物5′-GACCATGGAGGTTTCGTCCAGT-3′。所用引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5.5 MSP检测Bcl-2启动子区甲基化 以DNA抽提纯化试剂盒提取心肌组织DNA，并通过分光光度测定DNA浓度，DNA总量取500 pg，采用无菌去离子水将DNA体积补足至20 μL，加入CT转化试剂130 μL、98 ℃孵育10 min、64 ℃孵育150 min，10 μL溶解液洗脱DNA，4 ℃保存20 h。采用Methptimer软件设计Bcl-2外引物、MSP引物，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit说明书进行操作，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，退火温度51 ℃→41 ℃(每个循环降低0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20个循环，之后再以第一次PCR产物作为扩增模板，使用Bcl-2甲基化引物、非甲基化引物进行第2次扩增，扩增条件同上。Bcl-2外引物：正向引物5′-GTTTTGTTTTTATTTATTTAGTAGTTTTT-3′，反向引物5′-AATCCTATAATATTTTCCCCTTCTC-3′；Bcl-2甲基化引物：正向引物5′-GTTTTCGTTTTCGGTTTTTTTATC-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCGAC-3′；Bcl-2非甲基化引物：正向引物5′-TTTTTGTTTTTGGTTTTTTTATTGT-3′，反向引物5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCAAC-3′。将获得产物进行琼脂糖凝胶电泳(电压80 V，25 min)，采用凝胶成像系统测量Bcl-2甲基化和Bcl-2非甲基化条带的相对灰度值，将Bcl-2甲基化/非甲基化比较作为Bcl-2启动子区DNA甲基化水平。

2 结 果

2.1 各组心肌损伤标志物水平比较 模型组CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平高于对照组(P<0.05)；伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平低于模型组(P<0.05)，且呈剂量效应(P<0.05)。详见表1。

表1 各组心肌损伤标志物水平比较(±s)

2.2 各组大鼠心肌组织病理HE染色结果 HE染色结果显示：模型组心肌组织存在明显炎性浸润、细胞坏死；伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组心肌组织损伤较模型组得到明显改善。详见图1。

图1 各组心肌组织HE染色图像(×400)(A为对照组；B模型组；C为伊伐布雷定低剂量组；D为伊伐布雷定中剂量组；E为伊伐布雷定高剂量组)

2.3 伊伐布雷定对病毒性心肌炎大鼠心肌组织凋亡的影响 模型组心肌组织细胞凋亡指数、Bax mRNA、CytC mRNA高于对照组(P<0.05)，Bcl-2 mRNA低于对照组(P<0.05)；伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组心肌组织细胞凋亡指数、Bax mRNA、CytC mRNA低于模型组(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平高于模型组(P<0.05)，且呈剂量效应(P<0.05)。详见图2、表2。

图2 各组心肌组织TUNEL图(×400)(A为对照组；B为模型组；C为伊伐布雷定低剂量组；D为伊伐布雷定中剂量组；E为伊伐布雷定高剂量组)

表2 各组凋亡指数和Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、CytC mRNA相对水平比较(±s)

2.4 各组Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平比较 MSP检测结果显示：模型组Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平高于对照组(P<0.05)；伊伐布雷定低剂量组、中剂量组、高剂量组Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平低于模型组(P<0.05)，且呈剂量效应(P<0.05)。详见图3、表3。

图3 各组Bcl-2基因启动子区DNA甲基化电泳图(M为甲基化；U为非甲基化；A为对照组；B为模型组；C为伊伐布雷定低剂量组；D为伊伐布雷定中剂量组；E为伊伐布雷定高剂量组)

表3 各组Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平比较(±s)

3 讨 论

心肌炎是伴有心肌炎症和损伤的心脏疾病，CVB3是引起病毒性心肌炎发病的常见病因[11]。病毒进入机体后，直接产生细胞病变效应、病理性免疫反应或引起机体产生自身免疫效应。CVB3与其受体结合后，释放病毒蛋白酶可切割宿主细胞中的各种蛋白质，如切割Bcl-2家族中的Bid，促进心肌细胞凋亡。CVB3感染后通过蛋白酶体依赖性途径诱导细胞周期蛋白D切割，引起宿主细胞生长停滞[12]。病毒感染、心肌细胞坏死引起细胞内抗原释放，导致自身免疫性T细胞活化，加重病毒性心肌炎心肌损伤[13]。病毒性心肌炎引起心率加速，心率加速可增加心血管疾病病人死亡风险，同时心率加速也受到体内炎症严重程度的影响[14]。因此，病毒性心肌炎临床治疗时需给予减慢心率的药物治疗。伊伐布雷定是窦房结If电流选择特异性抑制剂，延长窦房结自动去极化时间以缓解心率过快[15]，且对心肌收缩力和心脏传导能力无影响。已有研究表明，伊伐布雷定对炎症反应和氧化应激反应有缓解作用[16]。

本研究结果显示，病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平升高，通过伊伐布雷定干预后可降低病毒性心肌炎大鼠CK-MB、Mb、cTnI和LDH水平，且表现为剂量效应。LDH为糖原溶解酶，组织细胞受损时，LDH含量升高。CK-MB是心肌组织损伤标志物，其水平异常升高与心肌组织受损严重程度有关[17]。肌钙蛋白是分布于心肌细胞纤维上的一种调节蛋白，cTnI是肌钙蛋白亚单位之一，正常生理状态下cTnI以结合形式分布于肌原纤维，极少数cTnI分布于细胞胞浆，心肌细胞膜受损时cTnI通过心肌细胞膜进入血液循环系统，此时血液cTnI含量升高[18]。本研究结果显示，病毒性心肌炎大鼠心肌组织细胞断裂明显、细胞排列紊乱且细胞核固缩；伊伐布雷定干预后病毒性心肌炎大鼠心肌组织细胞核固缩症状减轻且细胞排列较紧密，说明CVB3诱导病毒性心肌炎大鼠心肌组织存在严重损伤，给予伊伐布雷定干预可有效缓解病毒性心肌炎大鼠心肌组织损伤严重程度。

本研究结果还显示，病毒性心肌炎大鼠心肌组织细胞凋亡指数升高，给予伊伐布雷定干预可降低心肌组织凋亡指数，说明伊伐布雷定可减少病毒性心肌炎大鼠心肌组织凋亡。细胞凋亡是病毒性心肌炎性细胞死亡的作用机制之一，病毒性心肌炎急性期，心肌组织存在细胞凋亡，这些凋亡细胞主要是浸润于局部心肌组织的炎性细胞，随着病毒性心肌炎病情进展，心肌细胞和心肌纤维化细胞发生凋亡。细胞凋亡的发生主要有3种途径，包括线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。Bcl-2主要分布于线粒体膜外，具有调节线粒体膜通透性作用，Bax是线粒体膜成分之一，Bax表达上调促进CytC穿过线粒体膜进入胞质，激活细胞凋亡[19]。Bcl-2蛋白家族在线粒体外膜通道形成过程中发挥重要作用，其中促凋亡蛋白Bax可在线粒体外膜产生释放孔道，有助于膜间隙中的可溶性蛋白经过此孔道进入细胞质，正常生理状态下不影响线粒体内膜功能和基质功能[20]。受到凋亡信号刺激时，Bax构象发生变化并寡聚在线粒体膜上，形成较大孔道，将CytC从线粒体中释放，Bcl-2可降低线粒体膜通透性，抑制CytC释放[21]。CytC是电子传递链复合体中的组成部分之一，具有传递电子作用，定位于线粒体膜间隙，电稳定性结合于线粒体膜，受到凋亡信号刺激时，经孔道进入细胞质，之后在系列作用下形成凋亡体，活化Caspase途径，促进凋亡[22]。本研究结果显示，病毒性心肌炎大鼠心肌组织Bax mRNA、CytC mRNA、Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平升高，给予伊伐布雷定干预逆转这种趋势，而Bcl-2 mRNA水平降低。启动子区DNA甲基化属于表观遗传学修饰方式之一，通过调控基因的甲基化可调节基因表达水平，在生长发育过程中发挥重要作用[23]。高等生物中DNA甲基化必须在甲基转移酶作用下将甲基转移至胞嘧啶的第5C上，使其产生5甲基胞嘧啶。本研究结果显示，伊伐布雷定对病毒性心肌炎大鼠心肌组织凋亡的改善作用可能与调节CytC mRNA、Bax mRNA水平有关，还可能通过降低病毒性心肌炎大鼠心肌组织Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平，进而提高Bcl-2 mRNA水平，影响线粒体介导的凋亡途径，降低病毒性心肌炎大鼠心肌组织凋亡指数。

综上所述，伊伐布雷定对CVB3诱导发生的病毒性心肌炎大鼠心肌组织细胞凋亡具有缓解作用，可降低心肌组织细胞Bax mRNA、CytC mRNA水平，提高Bcl-2 mRNA水平，可能与降低病毒性心肌炎大鼠心肌组织细胞Bcl-2基因启动子区DNA甲基化水平有关，但具体作用机制需进一步研究。