糖尿病视网膜病变患者PERK、CHOP和IRE表达水平变化意义分析

冯应华

许昌市第五人民医院，河南 许昌 461100

糖尿病与心脑血管疾病、恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的主要影响疾病并具有显著的老年化趋势，发病率和死亡率逐年升高［1］。糖尿病多见微血管并发病变，以糖尿病视网膜病变（DR）发生率最高，严重降低了患者正常视力，亦是临床致盲的重要原因［2］。对于糖尿病视网膜病变具体发生、发展机制尚不明晰，多认为是视网膜微血管病变损伤诱发。

内质网是细胞蛋白质合成及加工主要场所之一，细胞受到外部刺激后由于内部的内质网应激过程，可诱发一系列病理生理过程并有研究［3］提示糖尿病视网膜病变可能与内质网的应激反应及相关蛋白的异常凋亡存在关系。因此，本研究以内皮细胞内质网应激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP为研究重点，对糖尿病视网膜病变患者血清PERK、CHOP和IRE水平及意义进行了深入探讨，现汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2018年8月在许昌市第五人民医院治疗的糖尿病患者210例，其中有糖尿病视网膜病变患者60例（DR组），其中非增殖期视网膜病变（NPDR）患者34例，增期期视网膜病变（PDR）患者26例，无视网膜病变患者150例（DM组），同时选取健康者100例作为对照组，DR组、DM组和对照组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准［4］：（1）糖尿病诊断符合1999年世界卫生组织制定的标准；（2）DR诊断符合2014年国际眼科理事会糖尿病眼部保健指南中的标准，视网膜病变经直接眼底镜检查或眼底荧光血管造影确诊；（3）患者及家属知情同意。排除标准：（1）合并有高血压、恶性肿瘤、肝肾功能障碍、HIV感染等其他严重基础性疾病；（2）有青光眼、白内障等眼部疾病；（3）1型糖尿病，见表1。

表1 DR组、DM组和对照组一般资料比较

1.2 实验方法

采用Western blot检测视网膜中PERK、CHOP和IRE表达。组织匀浆法提取视网膜组织总蛋白；取50 ug总蛋白SDS-PAGE裂解后转膜，牛血清蛋白（30 g/L）2 h封闭、分别加入兔抗大鼠PERK、CHOP和IRE一抗，4℃孵育后加入辣根化得IgG二抗，暗室条件下曝光显影［5］。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组组织PERK、CHOP和IRE表达水平

DR组组织PERK和IRE相对表达量明显高于对照组和DM组（P＜0.05）；DR组组织CHOP相对表达量明显高于对照组（P＜0.05），而与DM组比较无统计学意义（P＞0.05）；DM组组织PERK、CHOP和IRE相对表达量明显高于对照组（P＜0.05），见表2、图1。

表2 各组血清PERK、CHOP和IRE表达水平（±s)

注：a与对照组比较P＜0.05；b与DM组比较P＜0.05

组别对照组（n=100）DM组（n=150）DR组（n=60）FP PERK相对表达量0.412±0.098 1.022±0.103a 1.382±0.112ab 10.022＜0.050 CHOP相对表达量0.202±0.091 1.021±0.101a 1.011±0.110a 11.287＜0.050 IRE相对表达量0.312±0.110 0.570±0.102a 0.880±0.102ab 12.281＜0.050

2.2 DR组不同分型患者组织PERK、CHOP和IRE表达水平

DR组PDR患者组织PERK和IRE相对表达量明显高于NPDR患者（P＜0.05）；DR组NPDR和PDR患者CHOP相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 DR组不同分型患者血清PERK、CHOP和IRE表达水平（±s)

分型NPDR（n=34)PDR（n=26)tP PERK相对表达量1.300±0.108 1.404±0.110-3.667＜0.050 CHOP相对表达量1.004±0.102 1.014±0.101-0.378＞0.050 IRE相对表达量0.821±0.103 0.922±0.104-3.748＜0.050

2.3 相关性分析

将DR患者组织PERK、CHOP和IRE表达进行相关分析，结果显示：DR患者PERK和IRE呈正相关（r=0.402，P＜0.05）；CHOP与PERK、IRE无明显相关性（P＞0.05）。

3 讨论

糖尿病患者由于持续维持在高血糖及长期血糖不稳，诱发血小板凝集力升高，损伤微细血管，诱发微细血管局部膨大、水肿、渗漏、出血及阻塞等症状，而微细血管阻塞后由于视网膜缺氧致使视网膜血管大量增生并伴随纤维增生，最终导致糖尿病视网膜病变［6-7］。研究［8］提示糖尿病视网膜病变的疾病进展后可造成黄斑部水肿而降低视力，玻璃体出血后还可造成突发性模糊，严重患者甚至出现视网膜剥离及新生血管性青光眼造成视力下降，但现阶段的本病的具体机制尚不明晰。

内质网在保证内环境稳态的重要条件，但受到外界的强烈刺激后极易诱发内质网应激。内质网是蛋白质加工、合成及修饰出现异常的重要过程并被研究证实参与了糖尿病并发症的发生、发展过程［9-10］。动物研究［11］提示糖尿病大鼠周围神经内质网应激影响参与了大鼠周围神经系统的异常过程并提出糖尿病视网膜病变中内质网应激发挥了重要作用。文献［12］提示对于糖尿病视网膜病变的内质网应激导致的细胞凋亡参与了视网膜细胞损伤进程。本研究结果显示DR组血清PERK和IRE相对表达量明显高于对照组和DM组；DR组血清CHOP相对表达量明显高于对照组，而与DM组比较无统计学意义；DM组血清PERK、CHOP和IRE相对表达量明显高于对照组。该结果说明糖尿病视网膜病变患者PERK、CHOP和IRE表达明显升高。PERK属于elF2a上游激酶家族一种I型跨膜蛋白，在内质网膜上表达。内质网应激早期存在PERK信号通路的激活，该通路主要通过抑制蛋白质的合成对细胞起保护作用、促进细胞生存。研究［13］提示随着内质网应激时间的延长及PERK特异性的磷酸酶去磷酸化抑制PERK，PERK通过诱导CHOP及IRE的表达而促进细胞凋亡，在调控的信号途径在中枢神经系统及代谢异常等病理过程中发挥重要作用。研究［14］提示LPS诱导的细胞能够抑制内质网钙泵，诱发内质网应激反应，促进CHOP表达，这也与本研究结论一致。

进一步对DR组不同分型患者组织凋亡蛋白结果显示DR组PDR患者组织PERK和IRE相对表达量明显高于NPDR患者；DR组NPDR和PDR患者CHOP相对表达量比较差异无统计学意义。该结果说明增殖期视网膜病变PERK和IRE相对表达量明显高于NPDR患者并存在较强的内质网应激反应。进一步将DR患者组织PERK、CHOP和IRE表达进行相关分析，结果显示：DR患者PERK和IRE呈正相关；CHOP与PERK、IRE无明显相关性。该结果说明糖尿病视网膜病变患者PERK、CHOP和IRE的异常表达可能与视网膜病变的发展具有密切关系，可能与内皮细胞内质网应激蛋白PERK、IRE及凋亡蛋白CHOP诱发的内质网应激反应关系密切。

PERK通路及CHOP通路均为内质网应激反应的两条重要通路。PERK属于蛋白激酶家族，内质网无应激时C端位于细胞质中，N端位于内质网腔，C端由苏氨酸蛋白激酶活性，但缺乏核酸内切酶活性，而当内质网处于应激状态时，PERK解离形成寡聚体并因自身磷酸化激活具有特异性的丝氨酸，降低蛋白翻译水平，进而抑制胞内蛋白合成［15］。CHOP是内质网应激反应中的另一转录因子，正常条件下CHOP主要机体含量极低，但内质网应激状态时CHOP表达量聚集于细胞核内，水平迅速升高进而加速细胞凋亡进程。此外，CHOP还具有调节Bcl-2基因等其他基因的转录，与cAMP反应元件结合蛋白形成二聚体促进线粒体对促凋亡因子的敏感性，抑制Bcl-2表达。

综上所述，糖尿病视网膜病变患者PERK、CHOP和IRE表达明显升高，可能在病变过程中有重要作用。