黄栌枯萎病菌巢式PCR检测方法的建立

夏 菲,周江鸿,车少臣,仲 丽,赵正楠

(园林绿地生态功能评价与调控技术北京市重点实验室,北京市园林科学研究院,北京100102)

黄栌(Cotinus coggygria)为漆树科(Anacardiaceae)黄栌属(Cotinus)植物,落叶灌木或小乔木,秋季叶色变红,极具观赏价值和经济价值,是北京香山公园秋季红叶景观的主要树种。自上世纪80年代香山发现黄栌枯萎病以来[1],其发生有逐年加重的趋势。该病害导致黄栌叶片萎蔫,同时自叶缘向内发黄,或失水卷曲,但通常不脱落;根、茎的维管束出现坏死,木质部与皮层交界处出现褐色带线,部分树杈迅速死亡,发病严重时可导致整株长势衰弱或死亡。

黄栌枯萎病的病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),其无性世代属于半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)轮枝孢属(Verticillium),菌落表面常形成黑色微菌核,其温度适应范围较宽,具有耐高温特性[2]。大丽轮枝菌为典型土壤习居菌,土壤中的微菌核萌发产生的菌丝通过黄栌根系表面的伤口侵入维管束,然后产生分生孢子沿维管束随蒸腾流向上扩展[3]。大丽轮枝菌在寄主体内扩展缓慢、潜伏期长,当叶片出现明显萎蔫症状时,其根部及茎干内已经存在大量病原菌[4],使其易错过最佳防治期,造成病害大面积暴发[5]。传统的病原物分离、鉴定技术费时费力,难以对大量苗木进行快速检测,因此建立快速、高灵敏度的黄栌枯萎病菌检测技术对黄栌枯萎病的防治具有重要意义。

基于PCR技术的检测方法具有快速、灵敏等特点,已广泛用于病害的诊断和鉴定。朱有勇等[6]根据棉花黄萎病菌(V.dahliae)核糖体基因ITS区段的碱基编码序列,设计了一对26 bp的PCR特异性扩增引物P1∕P2,用于棉花黄萎病菌的分子鉴定和分子监测。但常规PCR灵敏度较低,不适合进行黄栌枯萎病菌的快速检测;相比之下,巢式PCR灵敏性更高。本研究基于大丽轮枝菌特异性引物P1∕P2扩增出的片段序列设计巢式PCR引物,以期为黄栌枯萎病早期诊断和快速检测提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

大丽轮枝菌:2014年5月于北京香山公园采集黄栌枯萎病感病枝条,采用常规组织分离法分离培养病原菌,经鉴定为大丽轮枝菌,低温保存备用。海棠腐烂病菌(Valsa ceratosperma)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和茎点霉菌(Phoma sp.)用于检测引物特异性,均由北京市园林科学研究院植保所提供。

1.2 供试引物

基于大丽轮枝菌ITS序列设计特异性引物P1(5′-CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG-3′)∕P2(5′-CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA-3′)[6],用于大丽轮枝菌常规PCR和巢式PCR第一轮扩增。

1.3 黄栌枯萎病菌及植物样品基因组DNA的提取

将供试黄栌枯萎病菌在PDA培养基培养10 d后,刮取菌丝,采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(B518259)[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取总DNA。采集植物叶片组织,采用新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因组DNA。

1.4 黄栌枯萎病菌巢式PCR检测体系的建立

1.4.1 引物设计及特异性筛选

以黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板,利用大丽轮枝菌ITS序列特异性引物P1∕P2,在C1000 Touch梯度PCR仪(Bio-Rad,美国)上进行扩增,将其产物与载体连接,并转化大肠杆菌,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。根据其碱基序列,使用Primer3 Input(v.0.4.0)软件在线设计3对引物(表1),分别进行PCR扩增,筛选最合适的特异性引物。

表1 供试引物Table 1 Primers used in this study

PCR反应体系(25μL):10×PCR buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP 0.5μL(10 mmol∕L),上下游引物各1μL(10μmol∕L),Taq DNA聚合酶0.2μL(5 U),DNA 1μL(30 ng∕μL),加ddH2O至终体积25μL。

PCR程序:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,Tm℃退火45 s,72℃延伸40 s,30个循环;72℃延伸7 min。取5μL PCR产物于含GelRed核酸染料(Biotium,美国)的1.0%琼脂糖凝胶中电泳20 min(150 V),Quantum CX5凝胶成像系统(Vilber,法国)观察并拍照。

以海棠腐烂病菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、茎点霉菌和黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板,使用设计的引物分别进行PCR扩增,以ddH2O为阴性对照,检测3对引物的可扩增性和产物特异性,选取只能在黄栌枯萎病菌DNA中扩增出单一且较亮条带的引物。

1.4.2 扩增条件优化

第一轮扩增引物选用朱有勇等[6]设计的特异性引物P1∕P2,设置61℃、58℃、55℃和52℃四个退火温度,对其扩增产物进行凝胶电泳检测。第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板,PN1∕PN2为引物,设置61℃、58℃、55℃和52℃四个退火温度,筛选引物最优退火温度。

1.4.3 PCR检测灵敏度

使用N50 Touch超微量分光光度计(Implen,德国)测定黄栌枯萎病菌DNA浓度,采用10倍梯度稀释,再将不同稀释浓度的DNA作为模板,分别用常规PCR和巢式PCR进行扩增,验证检测方法的灵敏度。

1.5 黄栌样品的巢式PCR检测

以发病黄栌上表现黄化和萎蔫症状的叶片为显症材料,发病植株正常枝条上的叶片和发病区域表现正常植株的叶片为未显症材料。在试验地采集8份样品,包括:发病区域表现正常的植株叶片、发病植株未显症叶片、健康黄栌叶片(阴性对照)、显症黄栌叶片,各2份,使用P1∕P2和PN1∕PN2引物,按1.4.2筛选出的扩增条件,进行巢式PCR检测。用荧光定量PCR方法检测上述DNA样品中目的基因拷贝数,得到各个黄栌叶片样品中所携带的枯萎病菌绝对数量。

2 结果与分析

2.1 引物的可扩增性及产物特异性筛选

以黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板,利用设计的3对引物分别进行PCR扩增,对其可扩增性进行筛选。凝胶电泳结果显示,引物PN1∕PN2能扩增出片段长度为176 bp的单一条带(图1),非以黄栌枯萎病菌基因组DNA为模板的泳道未扩增出条带(图2)。这表明,PN1∕PN2可以作为检测黄栌枯萎病菌的特异性引物。

图1 设计引物的可扩增性筛选Fig.1 Screening for amplification effect of the designed primers

图2 引物PN1∕PN2扩增产物特异性分析Fig.2 Specificity analysis for primers PN1∕PN2

2.2 扩增条件优化

PCR扩增产物的凝胶电泳结果如图3所示:P1∕P2引物的退火温度为58℃时扩增条带最清晰,第二轮扩增使用的是引物PN1∕PN2,在退火温度为55℃时条带最为清晰。

图3 PCR扩增体系优化Fig.3 Optimized single PCR reaction system

2.3 巢式PCR灵敏度分析

黄栌枯萎病菌DNA初始浓度为23.25 ng∕μL,10倍梯度稀释后分别作为模板,使用PN1∕PN2进行普通PCR扩增(图4A),使用P1∕P2和PN1∕PN2进行巢式PCR扩增(图4B)。结果表明:引物PN1∕PN2进行普通PCR扩增最低可检测出来的黄栌枯萎病菌DNA浓度为2.325×10-2ng∕μL,PN1∕PN2进行巢式PCR扩增最低可检测出来的DNA浓度为2.325×10-4ng∕μL,巢式PCR的灵敏度是普通PCR的100倍。

图4 普通PCR和巢式PCR扩增灵敏度分析Fig.4 Sensitivity analysis for ordinary PCR and nested PCR

2.4 黄栌样品检测

以引物P1∕P2进行的第一轮PCR扩增,只有显症黄栌叶片的2份样品扩增出324 bp的特异性片段,其余样品中均未扩增出条带(图5A);以引物PN1∕PN2进行的第二轮PCR扩增,除了健康黄栌叶片样品中未扩增出条带,其他样品中均扩增出176 bp的特异性片段(图5B),2份显症黄栌叶片和4份未显症黄栌叶片样品中都检测出枯萎病菌。实时荧光定量PCR检测结果表明,发病区域表现正常植株的叶片、发病植株未显症叶片、显症黄栌叶片中大丽轮枝菌的绝对数量分别为25.41 copies∕g、1.35×102copies∕g、7.02×104copies∕g,在健康黄栌叶片中未能检测到大丽轮枝菌的存在。可见,在未显症黄栌叶片中也存在枯萎病菌,其含量较低,利用本研究建立的巢式PCR检测体系均能扩增出较清晰片段,可用于黄栌枯萎病的早期诊断。

图5 黄栌叶片中枯萎病菌的巢式PCR检测Fig.5 Detection of V.dahliae in leaves of C.coggygria by Nested PCR

3 讨论

黄栌枯萎病是系统性侵染病害,严重影响黄栌的观赏价值、生态价值及经济价值。目前,仍未有效控制该病害的发生[7-8]。感染树木并引起枯萎病的轮枝菌多数为大丽轮枝菌,其已知寄主植物超过200种,许多园林植物及林下杂草都是其无症状带菌体,这些植物虽然体内含有大丽轮枝菌,但本身并不表现任何症状,是黄栌枯萎病菌传播的重要介体[9-10]。

本研究构建的巢式PCR检测方法仅在感染了大丽轮枝菌的黄栌样品中扩增到特异性目的片段,保证了PCR扩增的特异性。与常规PCR相比,该巢式PCR检测方法经过两轮PCR反应,其灵敏度是普通PCR的100倍,表明此巢式PCR检测体系检测结果更精准,可用于黄栌枯萎病的早期诊断。

大丽轮枝菌主要以微菌核形式存活于土壤中,在外部环境适宜的条件下,微菌核可迅速萌发并成为病害初侵染源[11],因此对土壤中微菌核的监测预警也十分必要。本研究构建的巢式PCR检测方法同样可用于土壤中大丽轮枝菌的定性检测,但由于土壤中含有较多的腐植酸、酚类化合物、不明沉淀物和菌体裂解成分等物质,如何提取高质量的DNA成为土壤中病原菌检测的难点,接下来将持续进行相关研究。