水稻MKKs基因在发育过程中对非生物胁迫处理的表达特征分析

余舜武,张小庆,陈守俊,叶水烽,张 余,罗利军

(上海市农业生物基因中心,上海201106)

植物的生长发育和逆境胁迫反应是在复杂的信号调控网络下完成的,其中蛋白质磷酸化过程具有重要的信号传递功能。研究表明:细胞分裂原激活的蛋白激酶(MAPK,mitogen-activated protein kinase)级联磷酸化过程在酵母、植物、动物等真核生物中普遍存在,参与细胞分裂、生长、激素信号传递及对外界环境的适应[1-2]。MAPK级联途径在真核生物中高度保守,一般存在3种类型的蛋白激酶:MAPKKKs(MAPKs激酶的激酶)、MKKs(MAPKs激酶)和MAPKs。这3种激酶从上到下逐级磷酸化,将信号放大并传递下去,最后通过MAPKs磷酸化不同底物,如转录因子、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等,特异性调节下游基因的表达,使细胞、组织、器官及整个生物体作出相应反应[1-2]。

植物中的MAPK级联途径错综复杂,涉及发育和胁迫响应信号的传导与整合。不同的发育或胁迫信号可能通过同一条激酶链传递,同一来源的信号又有可能通过不同的激酶链传导,在错综复杂的信号网中MAPK级联系统将信号巧妙有序地传递[1-3]。在三级级联系统中,MKK家族基因位于中间,成员数最少,已知拟南芥、水稻和杨树中只有8—10个成员,但第一级MAPKKK家族成员在拟南芥中多达80个,第三级MAPK家族也有20个成员[4]。在复杂的MAPK级联中,MKKs在MAPK级联各条途径中起到了枢纽作用,能够有效地协调上游MAPKKKs和下游MAPKs之间的信号传递。

MAPK家族基因最开始被发现与酵母细胞分裂和分化相关[5],该系统在植物中也是保守存在的,如AtMKK6基因参与拟南芥细胞分裂[6-7]。此外,MAPK也被发现参与植物激素调控的生长,如AtMKK7基因过量表达抑制生长素的极性运输,导致拟南芥畸形发育[8]。还有报道认为水稻MKK4级联系统调控谷粒大小[9]。但进一步研究认为,MAPKK家族基因与各种抗逆信号相关,在抗病性和非生物胁迫中扮演更重要角色。如油菜BnMKK1基因能响应多个非生物胁迫和激素处理,过量表达该基因改变了烟草株型,也改变了转基因烟草的抗旱性和抗病能力[10];水稻OsMKK3和OsMK K10.2基因正调控植物的抗病性,其中OsMK K10.2基因还能改善水稻的抗旱性[11-12]。

全基因组范围内研究MAPKK家族基因的表达模式已在拟南芥、枣、甜椒、西瓜和黄瓜等物种中开展,研究发现MAPKK家族基因与生长发育和逆境胁迫相关,水稻中也有MKKs基因的相关研究,但并不充分[3,13-16]。为全面了解水稻MKKs基因在水稻发育进程、激素和非生物逆境胁迫下的表达特点,本试验利用不同发育时期不同器官组织的芯片表达数据和模拟非生物胁迫处理的定量PCR分析研究水稻中MKK家族基因在发育内部信号和环境外部逆境信号下的表达模式,以期为进一步解析水稻MKKs基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和处理

试验材料为水稻品种‘日本晴’,在正常的光照培养条件下培养至水稻幼苗三叶一心期,分别用PEG6000(聚乙二醇6000)、NaCl、冷、热和植物生长调节剂ABA(脱落酸)处理这些材料。

PEG6000渗透胁迫是将水稻幼苗由标准水稻营养液移入含20%PEG6000的水稻营养液中;NaCl处理是将幼苗由标准营养液移入含150 mmol∕L NaCl的营养液中;热处理是将植株放在42℃生长箱中生长;冷处理是将植株放入4℃生长箱中生长;ABA处理是用100μmol∕L ABA喷洒水稻叶片。在处理前(即0 h)、处理后3 h、6 h、12 h、24 h以及恢复正常培养后24 h分别剪取叶片,迅速放入液氮中保存以备后续试验使用。

1.2 OsMKK蛋白序列分析

根据国家水稻数据中心(http:∕∕www.ricedata.cn∕gene∕index.htm)水稻基因数据,搜索TIGR Rice Genome Annotation(http:∕∕rice.plantbiology.msu.edu∕)数据库并下载水稻OsMKK蛋白序列,从NCBI(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gene∕)数据库下载拟南芥MKK蛋白质序列,利用Clustal X对水稻和拟南芥MKK蛋白序列进行比对分析,然后利用MEGA 4软件构建Neighbor-joining进化树。

1.3 OsMKK基因芯片表达谱分析

从CREP(http:∕∕crep.ncpgr.cn)芯片表达数据库中提取水稻OsMKK基因的表达数据,分别提取了‘珍汕97’‘明恢63’和‘汕优63’3个水稻品种27个发育时期和组织的表达信号值和三叶幼苗期经赤霉酸(GA3)、萘乙酸(NAA)和激动素(KT)等处理的表达信号值,具体数据见参考文献[2]。每个样品编号对应的发育时间和所取的组织见表1。

1.4 反转录定量PCR(qRT-PCR)分析

水稻叶片总RNA抽提采用Trizol法,具体使用方法参照中国TianGen公司TRNzol-A+Total RNA Reagent试剂盒说明书。以水稻总RNA为模板反转录合成无基因组DNA的第一链cDNA(北京全式金生物公司TransCript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒);然后以cDNA为模板,用定量PCR的方法进行表达量分析(TaKaRa SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒,PCR仪为ABI PRISM 7000 Real-Time PCR System)。用于定量PCR的MK K基因引物见表2。

表1 水稻不同发育时期芯片表达谱分析的组织样品Table 1 Tissue samples for microarray expression profile spectrum analysis of rice at different development stages

表2 水稻MKK家族基因成员和定量用PCR引物Table 2 Members of rice MKK gene family and primers used for qRT-PCR

2 结果与分析

图1 水稻和拟南芥MKK蛋白家族的进化树Fig.1 Phylogenetic tree of MKKs protein family in rice and Arabidopsis thaliana

2.1 OsMKK蛋白家族的进化树

参照TIGR Rice Genome Annotation(http:∕∕rice.plantbiology.msu.edu∕)数据库和国家水稻数据中心(http:∕∕www.ricedata.cn∕gene∕index.htm)相关数据,发现水稻中有8个OsMKK基因(表2),下载这些基因编码的蛋白序列进行比对分析,发现OsMKK蛋白均具有在激活环中保守的天冬氨酸和赖氨酸残基D(L∕I∕V)K和植物特异的磷酸化靶位点S∕TxxxxxS∕T。以拟南芥AtMKK蛋白序列作为参照,对OsMKK蛋白序列进行比对,构建Neighbor-joining进化树。如图1所示,OsMKK蛋白分为4个亚家族,其命名与拟南芥同源蛋白保持一致,A亚族包括OsMKK1和OsMKK6蛋白;C亚族包含OsMKK4和OsMKK5蛋白,但水稻中缺少AtMKK8—9蛋白;D亚族中与AtMKK10蛋白同源性最高的OsMKK10蛋白有3个;B亚族只有1个OsMKK3蛋白。

2.2 OsMKK基因在不同组织中的表达分析

CREP数据库公开了Affymetrix芯片检测数据,利用基因ID号搜索水稻OsMKK基因在‘珍汕97’‘明恢63’和‘汕优63’3个水稻品种27个不同发育时期组织器官的表达信号值。由于OsMKK10-3基因没有对应芯片探针信号值,故OsMKK10-3基因未纳入统计分析。结果表明:OsMK K基因表达模式在不同时期不同组织中表达存在差异,且品种间也存在差异(图2)。OsMKK1基因在不同组织中均能检测到表达,在叶片表达最高,幼穗中表达偏低,3个品种中‘珍汕97’表达最低。OsMKK4和OsMKK10-2基因表达与OsMK K1基因类似,叶片表达最高,幼穗中表达偏低。OsMKK3和OsMKK6基因表达模式聚在一起,OsMK K3基因整体表达量低,在幼穗中相对较高,胚乳中表达低,3个品种中‘珍汕97’表达相对偏高;OsMK K6基因整体表达量比OsMKK3基因偏高,其在愈伤组织、幼穗和胚乳中表达较高。OsMKK5与OsMK K10-1基因表达类似,雄蕊和幼穗中表达最低,但OsMKK10-1基因整体表达量很低,仅在胚乳中表达量高。表达模式聚类结果(图2)与蛋白同源性聚类结果(图1)不一致。

图2 OsMKK家族基因表达模式的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of OsMKK family genes expression patterns

2.3 OsMKK基因在激素处理后的表达分析

OsMKK基因对3种激素(GA3、NAA和KT)处理的表达数据值来源于CREP芯片数据。在不同激素处理下,OsMKK家族基因在3叶期的3个品种中表达量均呈现一定变化。以‘珍汕97’为例,OsMKK10-1、OsMK K3、OsMKK4和OsMK K6基因在激素处理后,除了个别处理稍有降低外,表达量均有一定提高(图3)。OsMK K1、OsMKK5和OsMKK10-2基因表达量在激素处理后略有降低(图3)。不同激素处理在品种间稍有变化,表明遗传基础的差异对激素反应存在一定影响。如GA3处理后,‘明恢63’的OsMKK5和OsMK K6基因表达量上升,而其他2个品种降低(图3)。

图3 NAA、GA3和KT处理后水稻MKK基因的表达谱Fig.3 Expression profiles of OsMKK genes treated with NAA,GA3 and KT

2.4 OsMKK基因在非生物逆境下的表达模式分析

对水稻幼苗模拟非生物逆境胁迫处理,取处理不同时间的叶片抽提总RNA,采用qRT-PCR的方法分析OsMKK家族基因的表达模式。如图4所示,20%PEG6000处理能诱导OsMKK家族基因的表达量上升。在处理的24 h内,OsMKK1、OsMKK3和OsMK K5基因在12 h时表达量最高,OsMKK4基因在处理24 h时最高。150 mmol∕L NaCl处理也能诱导OsMKK家族基因表达量上升,其中OsMK K1、OsMKK3、OsMK K4和OsMKK5基因在处理的24 h内表达量持续升高,但NaCl处理对OsMKK10-2上调表达影响不显著。低温处理时,OsMK K1、OsMKK4和OsMK K6基因表达量上升。高温能诱导OsMKK1和OsMKK3基因在早期表达量上升,9 h后逐渐下降恢复常量表达,OsMKK6和OsMK K10-2基因表达量呈下降趋势,但不显著。ABA处理能明显诱导OsMKK1、OsMKK3和OsMKK5基因表达。综上所述,在水稻MAPKK 4个亚家族中,A和C亚家族的OsMKK1、OsMKK6、OsMKK4和OsMK K5基因与非生物胁迫紧密相关,受干旱、盐、高温等胁迫和植物激素ABA诱导表达;B亚家族的OsMKK3基因与干旱、盐胁迫和ABA处理相关;D亚家族的OsMK K10-2基因在PEG6000和冷处理下略有上升,其他应答不明显,均与对照没有显著差异。以上结果说明,A∕B∕C亚家族的OsMKK基因均受非生物胁迫正调控。

图4 不同逆境处理下‘日本晴’幼苗OsMKK基因的表达量分析Fig.4 Analysis of OsMKK genes expression in‘Nipponbare’seedlings under different stress treatments

3 讨论

MKK家族基因是植物生长和逆境反应中重要的信号传导基因,其通过有限的几个MKK成员将多个功能途径共享到相同的MAPK级联信号系统中。从拟南芥MK K成员的时空表达特异性和复合信号系统的形成来看,MKK所参与的MAPK级联信号系统参与了植物的生长发育和防卫反应[17]。本研究中,从不同发育时期的不同组织器官中的表达来看,OsMKK家族基因在水稻生长发育中的不同时期均有表达,OsMK K1、OsMKK4和OsMK K10-2基因在营养器官中表达量偏高,而OsMKK3、OsMK K5和OsMKK10-1基因则在生殖器官中表达偏高,表明OsMKK家族基因在水稻生长发育的各个时期都扮演了重要的角色。OsMK K4基因所在的MAPK级联系统能调控细胞分化和细胞增殖来影响穗的发育[8]。OsMKK4和OsMK K5基因同是水稻OsMKK家族C组成员,OsMKK5基因在‘明恢63’‘珍汕97’和‘汕优63’3个品种的苗期表达量相对较低,但在穗及雄蕊中表达较高,说明OsMKK5可能与OsMKK4基因相似,参与调控花器官的发育。本研究还发现,OsMKK基因对生长激素也存在一定的响应,这与拟南芥中的研究结果相似。拟南芥同源基因AtMKK3参与了植物激素GA3信号的调控,对拟南芥白天和黑夜的转换起到重要作用[18]。此外,非生物胁迫处理也能诱导OsMKK4和OsMKK5基因表达明显上调,表明OsMKK基因家族C组成员在水稻非生物逆境和生长发育中均具有重要功能。值得注意的是,OsMKK基因家族A和B组成员对非生物逆境胁迫有响应,它们同时也在水稻生长发育过程中的各个组织中有表达,这些结果进一步表明植物中的MAPK级联控制信号系统错综复杂,涉及植物整个发育阶段和胁迫响应信号的传导和整合[1-3]。

本研究表明,OsMK K基因参与多种非生物胁迫,在渗透胁迫、盐、高低温等胁迫处理时表达量呈上升趋势。OsMK K1基因的表达能够被多种非生物逆境胁迫和ABA诱导,其同源基因AtMK K1∕2通过AtMEK K1-AtMKK1∕2-AtMPK4基因级联途径参与活性氧(ROS)平衡维持,使拟南芥在胁迫环境下正常生长,并能诱导与低浓度的活性氧有关的20个转录因子表达来应对环境胁迫[19]。除B亚家族只包含一个OsMK K基因成员外,其他亚家族都有2个以上成员,表明除B家族外的其他成员之间可能存在功能冗余。如A亚族中还存在一个OsMKK6基因成员,也参与盐胁迫响应,在盐处理下表达量上升。D亚家族的OsMK K10-2基因对非生物胁迫不敏感,这与水稻MKK家族其他的大部分基因不一样,因为它们的表达能被多种非生物胁迫诱导表达,因此水稻MKK家族绝大多数基因都参与逆境胁迫反应。这表明水稻MK Ks基因能够介导由不同非生物胁迫刺激的信号转导,但基因功能是否存在冗余或者是每一个MK K基因链接的上下游是否一致,还需进一步研究。

MKKs基因参与的信号调控网络是复杂的系统,除了参与多种非生物胁迫外,OsMK K基因也参与了生物胁迫响应。已有报道表明,水稻OsMKK3基因可激活下游MAPK和转录因子途径来抵抗水稻白叶枯病和褐飞虱侵害[12,20]。更重要的发现是OsMKK10-2基因不仅能提高水稻的抗病性,同时能提高水稻的抗旱性[11]。以上结果表明:MKKs基因参与的级联系统具有多功能性,处于中间的核心位置并扮演着核心作用,不仅调控植物的生长发育,而且还对植物在生物逆境和非生物逆境下的自我保护作用发挥重要作用,因此有必要充分挖掘和理清水稻MKKs基因的调控网络。MKK家族基因在不同品种中的表达差异可能会影响到水稻的表型和农艺性状,深入研究水稻种质资源中MKKs基因的功能差异,有助于解释品种间农艺性状的差异,为水稻的现代化育种提供理论参考。