利用CRISPR∕Cas9技术编辑水稻丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK

孙 佳,吴清清,周文昊,林冬枝,宋忠明,董彦君*

(1上海师范大学生命科学学院,上海市植物分子科学重点实验室,上海200234;2上海市种子管理总站,上海201103)

据报道,全世界一半以上的人口依赖稻米中的淀粉类碳水化合物和营养物质维持生命活动[1-4]。稻谷中胚乳质量约占总质量的90%,胚乳细胞的发育直接影响水稻的产量和品质。胚乳性状与稻米外观品质、碾磨加工品质和蒸煮食味品质密切相关。因此,研究稻谷中淀粉合成相关基因的功能对实现水稻的高产、优质以及创制水稻育种材料具有重要的意义[5]。

在植物中,丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)催化丙酮酸、腺苷三磷酸(ATP)和磷酸(Pi)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、腺苷一磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi)相互转化。PPDK大量存在于C4植物的叶绿体基质中,在C3植物中的表达量相对较低,主要存在于C3植物的未成熟种子、叶片、胚芽鞘和根中[6]。PPDK是C4植物光合作用的关键酶,催化CO2固定于PEP受体[7]。PPDK在C3植物种子中调节淀粉合成和氨基酸代谢,称为胞质型PPDK。在淀粉合成的过程中,胞质型PPDK可能起到以下作用:丙酮酸是由丙酮酸激酶(PK)催化PEP生成的,是一个不可逆反应,需要PPDK来进行逆反应,而淀粉的生物合成途径可能由PK和PPDK循环产生的信号控制[8]。PK和PPDK之间的循环能够增加细胞质溶胶中PPi的浓度[6]。研究表明,PPi能够诱导蔗糖合酶依赖性的途径。这对淀粉生物合成的早期过程是非常重要的,PPi在PPDK活性下降之后触发该途径,随后淀粉的生物合成在发育的宿主器官中发生[8-10]。

与其他的基因编辑技术相比,CRISPR∕Cas9基因编辑系统具有效率高、操作简单等优势[11],目前该技术在水稻基因编辑中得到一定应用。如邵高能等[12]利用CRISPR∕Cas9技术编辑‘中花11’香味基因Badh2,突变体籽粒中香味物质2-乙酰-1吡咯啉含量显著增加;Shan等[13]定点突变叶绿素合成基因CAO1,突变体叶片呈淡绿色;胡雪娇等[14]对赤霉素20-氧化酶基因SD1进行了定向编辑,获得半矮秆水稻品种;本实验室也成功对谷蛋白基因GluA3进行编辑,获得了谷蛋白含量下降的突变体[15]。目前,尚未见对水稻丙酮酸磷酸双激酶基因(P PDK)进行编辑及其对淀粉合成影响的研究。本试验利用CRISPR∕Cas9技术对粳稻品种‘嘉花1号’的PP DK基因进行编辑,以期探究其在水稻淀粉合成中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

遗传转化水稻材料选择浙江省嘉兴市农业科学院选育的高产优质粳稻品种‘嘉花1号’,种植在上海师范大学植物园的封闭试验基地水田中,采用常规水肥栽培管理。

1.2 CRISPR∕Cas9表达载体的构建和遗传转化

本试验使用的CRISPR∕Cas9载体由华南农业大学刘耀光院士提供[16]。利用CRISPR Primer Designer软件对丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK(LOC_Os05g33570)的第6外显子设计序列为5’-GCCAGCTGCAGTTGCTTCT-3’的19 bp长度靶点。表达载体构建参照曾栋昌等[17]的方法,遗传转化与组织培养参照周优等[15]的方法,获得水稻T0代苗。

1.3 q-PCR分析

提取编辑突变植株及野生型(WT)‘嘉花1号’开花15 d未成熟的胚乳组织的总RNA,并以之为模板反转录得到cDNA(提取RNA试剂盒为北京全式金生物技术有限公司TransZolTMPlant,反转录cDNA试剂盒为该公司TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)。采用q-PCR方法对水稻淀粉合成相关的8个基因(表1)进行RNA水平的表达量分析。

表1 转录水平分析所用引物Table 1 Primers used for transcription level analysis

1.4 淀粉粒扫描电子显微镜观察

选取编辑突变植株与‘嘉花1号’的成熟种子,干燥后用小刀在其横截面上平切使其断裂,取断裂后的半粒米作为观察材料,横切面向上,喷金之后用Hitachi SU8010高分辨扫描电子显微镜进行观察。

1.5 淀粉含量测定

收获的水稻种子干燥后,脱壳保存。首先选取质量接近的糙米粒放置在10个2 mL的EP管中(每管1粒),加入200μL蒸馏水后在高压锅中121℃蒸煮30 min;然后加入1个钢珠和800μL蒸馏水,进行粉碎;再将液体移至试管中定容至10 mL,加入10μL 0.02%(质量分数)的I-KI溶液,观察溶液颜色变化并拍照记录。选取糙米进行均匀粉碎,过100目(孔径150μm)筛,每个样本称取20 mg米粉,放入10 mL试管中,然后按照Megazyme公司(爱尔兰)的直链淀粉测定试剂盒和抗性淀粉测定试剂盒的操作程序,测定直链淀粉、抗性淀粉以及总淀粉含量。

1.6 糊化特性观察

选取4粒完整精米均匀放置于加有1.4%(质量分数)KOH溶液的培养皿(直径90 mm)中,加盖后静置在(30±2)℃的恒温箱内,23 h后观察米粒的糊化状态并拍照。同时,称取20 mg精米粉于1.5 mL的EP管中,加入0.5 mL 4 mol∕L的尿素溶液,观察米粉在尿素中的溶解度。

1.7 米粒外观与农艺性状调查

在本实验室封闭试验基地培育野生型‘嘉花1号’与编辑得到的T2代突变体植株,成熟后对‘嘉花1号’以及纯合编辑突变植株的株高、单株穗数、结实率、粒长、粒宽以及千粒重等农艺性状进行考察,并观察稻米外观。

2 结果与分析

2.1 CRISPR∕Cas9表达载体的构建与转基因水稻获得

采用边切边连和两轮巢式PCR的方法构建和扩增得到gRNA表达盒,将gRNA表达盒连接到MH质粒中再次构建重组载体(图1),并转入大肠杆菌(DH10B),扩大培养提取质粒,用特异引物B1∕BL(表2)扩增并测序。将测序正确的重组质粒转入根瘤农杆菌(EHA105)中,扩大培养,PCR扩增产物测序验证;侵染水稻‘嘉花1号’愈伤组织,获得组培植株后,利用载体特异引物HPT-F∕R(表2)扩增检测,共获得9株潮霉素阳性苗,其中有6株纯合和3株杂合的编辑突变植株。纯合突变类型均为PPDK基因第6外显子上的NGG前第4个碱基A缺失(图2)。通过与野生型‘嘉花1号’蛋白序列比对,发现翻译提前终止,突变体蛋白结构预测如图3所示。收取T0代转基因苗的种子,T1代分离出无转基因载体的纯合突变体,命名为ppdk3。

图1 gRNA表达盒连接MH质粒示意图Fig.1 Schematic diagram of gRNA expression box connecting MH plasmid

表2 PPDK基因靶点引物和特异引物Table 2 P PDK gene target primers and specific primers

图2 野生型(WT)和ppdk3突变体(M)测序结果对比以及DNA测序峰图Fig.2 Comparison of wide type(WT)and ppdk3 mutant(M)sequencing results and DNA sequencing peak diagram

图3 野生型(WT)和ppdk3突变体蛋白结构预测Fig.3 Protein structure prediction of wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.2 突变体中淀粉合成相关基因RNA表达水平分析

对ppdk3突变体中淀粉合成相关的8个基因(表1)RNA转录水平情况进行分析表明:与野生型‘嘉花1号’相比,突变体的8个淀粉合成相关基因mRNA表达量均有明显下调,尤其是颗粒结合型淀粉合酶基因(G BSSⅠ和GBSSⅡ)及可溶性淀粉合成酶基因中的SSⅢa、SSⅡa、SSⅣ-2的表达量下调到原来的1∕10—1∕5(图4)。可见,PPDK基因的突变不仅影响自身的转录表达水平,还抑制其他淀粉合成相关基因RNA的表达。

图4 野生型(WT)和ppdk3突变体淀粉合成相关基因的转录水平表达Fig.4 Transcription levels of starch synthesis related genes in wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.3 淀粉颗粒显微结构

用扫描电子显微镜观察野生型‘嘉花1号’以及ppdk3突变体的米粒横切面发现:野生型胚乳淀粉颗粒表面光滑,排列紧密,形状规则有棱角;而ppdk3突变体胚乳淀粉颗粒排列松散,颗粒明显变小,淀粉颗粒呈球形和不规则形(图5)。可见,P PDK基因突变可导致胚乳淀粉颗粒形状和排列发生很大变化。

2.4 稻米淀粉特征分析

将ppdk3突变体糙米蒸熟后打碎并加水稀释,加入I-KI溶液,通过溶液颜色变化观察其米粒中淀粉含量的变化。结果显示:ppdk3突变体I-KI染色溶液颜色明显浅于‘嘉花1号’(图6A),说明其直链淀粉含量降低。同时,分别测定其稻米直链淀粉和抗性淀粉含量发现:‘嘉花1号’的直链淀粉含量为24.4%,而ppdk3突变体为18.8%,与I-KI染色染色结果相符合;另外,ppdk3突变体稻米的抗性淀粉含量(0.039%)比‘嘉花1号’(0.025%)略有上升。

图5 野生型(WT)与ppdk3突变体的胚乳淀粉颗粒观察Fig.5 Observation on endosperm starch granules of wild type(WT)and ppdk3 mutant

图6 野生型(WT)和ppdk3突变体的I-KI溶液染色(A)、碱消值测定(B)和尿素溶液中的溶解度(C)Fig.6 I-KI solution staining(A),determination of alkali elimination value(B)and solubility in urea solution(C)of wide type(WT)and ppdk3 mutant

2.5 糊化特性分析

鉴于稻米的碱消值等级与糊化温度(GT)呈负相关,本试验采用碱裂解法间接测定稻米糊化温度[18]。结果表明:ppdk3突变体稻米的碱消值比野生型‘嘉花1号’低(图6B),说明ppdk3突变体稻米的糊化温度高于野生型;在尿素溶解性上,突变体稻米较野生型更难溶于尿素(图6C),说明ppdk3突变体稻米中支链淀粉结构发生了改变。

2.6 米粒外观与农艺性状调查

对‘嘉花1号’和纯合突变体成熟种子的糙米、精米以及横切面进行观察,均发现ppdk3突变体稻米的整个胚乳都表现为白色不透明粉质状(图7)。另外,该突变体的株高与‘嘉花1号’基本接近,单株穗数明显减少,千粒重明显下降,粒长稍有增大而粒宽不变(表3)。可见,水稻PPDK基因突变不仅影响胚乳淀粉特征,还影响其他农艺性状。

图7 野生型(WT)与ppdk3突变体的糙米(A、B)、精米(C、D)、米粒横截面(E、F)及成熟植株(G)观察Fig.7 Observation on brown rice(A,B),milled rice(C,D),cross section of rice grain(E,F)and mature plants(G)of wild type(WT)and ppdk3 mutant

表3 ‘嘉花1号’和ppdk3突变体的农艺性状调查Table 3 Investigation on agronomic traits of‘Jiahua 1’and ppdk3 mutant

3 讨论

CRISPR∕Cas9技术是近年应用较广的基因编辑技术,对靶基因进行特异性修饰只需通过一个gRNA和一个Cas9蛋白[19],具有成本低、制作简便、快速高效等特点。目前,已经成功利用CRISPR∕Cas9技术对水稻多个基因进行编辑。如对水稻直链淀粉合成基因Wx进行编辑,获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体[20];对水稻淀粉分支酶基因SBE3进行编辑,获得了高直链淀粉和高抗性淀粉含量的水稻新品系[21]。本试验成功利用CRISPR∕Cas9技术对淀粉合成过程中相关基因PPDK进行了编辑,也获得一种淀粉特征发生改变的突变体。

本试验在PPDK基因第6外显子区域设计特异性靶位点,构建单靶点,通过植物组培侵染,获得一种突变体ppdk3:靶点内缺失一个碱基A,蛋白翻译提前终止,导致该基因控制合成的蛋白失去了大部分的高级结构。突变体ppdk3的淀粉颗粒呈不规则形状,排列疏松,存在间隙,可能导致胚乳对光的折射率发生改变而产生白色粉质性状,这与何冰纾等[22]报道的flo(t)突变体由于不规则、排列疏松的淀粉颗粒造成粉质胚乳相似;同时,尽管突变体的米粒略有增大,但由于淀粉颗粒变小疏松,导致千粒重明显下降。另外,ppdk3突变体的抗性淀粉含量略有上升,这可能是造成突变体米粒糊化温度升高的原因之一。由于水稻淀粉合成相关基因尤其是G BSS表达下降,突变体米粒直链淀粉含量降低,I-KI染色颜色明显变浅。由此,推测PPDK基因对淀粉颗粒大小的形成与排列以及淀粉合成具有一定影响。