瓜类枯萎病抗性遗传育种研究进展

琚茜茜 黄如葵 黄熊娟 冯诚诚 黄玉辉 杨浩

（1.广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所 广西南宁 530007；2.广西蔬菜育种与新技术研究重点实验室 广西南宁 530007；3.广西乐土生物科技有限公司 广西南宁530007）

瓜类枯萎病（Fusarium wilt）又称萎蔫病，是由镰刀菌寄生引起的土传病害，也是瓜类生产中的毁灭性病害。随着瓜类蔬菜产业的快速发展，各地专业化和集约化种植，引发了严重的瓜类蔬菜连作障碍问题，枯萎病发病率呈直线上升趋势。据调查，在一般病区枯萎病的发病株率为12.30%~56.75%，而在重病区的发病株率达到85%以上，甚至全部死亡，给瓜类生产带来了巨大的经济损失。

枯萎病致病机理主要存在导管堵塞和毒素的作用。病原菌侵染植株后，分泌出水解酶，使细胞壁发生降解，引起植株根系中胼胝质的积累，从而造成导管堵塞以及养分运输受阻，最终使植株枯萎死亡[1]。并且毒素的合成能够使植株维管束细胞发生变褐、坏死等病理变化[2]。由于枯萎病病原菌具有寄主专化性，各分化型对不同瓜类作物的侵染力和致病力存在差异[3]，部分瓜类专化型菌株还存在不同的生理小种，防治十分困难。现有的防治措施未能有效防治瓜类枯萎病。因此，选育高抗枯萎病瓜类蔬菜新品种是最经济、有效的解决方法。目前，国内外已对瓜类枯萎病开展了较详细的研究，其中对西瓜、黄瓜枯萎病的研究较为深入[4]。本文主要对西瓜、黄瓜、苦瓜、冬瓜等瓜类作物枯萎病的抗性鉴定、抗性遗传、分子标记辅助育种等进行综合概述，以期为瓜类枯萎病的抗性遗传育种提供参考。

1 瓜类枯萎病抗性鉴定

选择合适的接种方法，是筛选鉴定抗性材料的基础。目前，关于瓜类枯萎病抗性鉴定的方法主要采用灌根接种法、伤灌根接种法及浸根接种法，在不同的瓜类上都开展了相关研究。在黄瓜上，国外使用比较普遍的方法是菌土法和灌根法[5]。而国内采用较多的方法是灌根接种法、浸根接种法和胚根接种法。周红梅等[6]采用灌根接种法、浸根接种法和胚根接种法进行枯萎病抗性鉴定，结果表明，浸根接种法发病迅速，整齐度、重复性好，是较理想的黄瓜枯萎病接种方法；董京萍等[7]以灌根的方式对 70个黄瓜自交系进行枯萎病抗性差异分析，分别筛选出了对枯萎病抗性最强和最弱的品系。在西瓜上，张学炜等[8]开展了西瓜抗枯萎病鉴定方法的研究，认为浸根法最好，最适宜浓度为 1×105~1×106孢子/mL。王喜庆等[9]对抗病鉴定方法进行了筛选，结果表明，最佳的方法为浸根接种法，最适宜浓度 1×105孢子/mL，2018年李晓慧等[10]也开展了此研究，认为伤根蘸孢法是较为理想的接种方法，该方法是在浸根接种法的基础上，对西瓜幼苗剪根处理，通过剪根控制伤根的均匀程度。在甜瓜上，王登明等[11]和刘朋义等[12]分别采用不同接种方法进行抗性接种鉴定研究，认为浸根接种法操作简单、精确，最适合进行甜瓜枯萎病抗病鉴定研究，并成功鉴定出甜瓜高抗枯萎病材料。关于苦瓜枯萎病抗性接种鉴定的方法，也开展了少量的研究。郭堂勋等[13]研究认为，浸根接种法较适用于苦瓜枯萎病的抗性鉴定。陈振东等[14]采用苗期浸根接种法对143份苦瓜高代自交系材料进行枯萎病抗性评价，鉴定出高抗枯萎病特性的材料 1份、抗病材料 2份、中抗材料5份。众多研究表明，开展瓜类枯萎病苗期接种鉴定，最佳的方法是浸根接种法，操作简单、结果准确。

2 瓜类枯萎病抗性遗传研究

瓜类枯萎病抗性遗传规律较为复杂，遗传抗性呈现多种特点。目前，国内外有关瓜类枯萎病抗性遗传作用机理的研究主要集中在黄瓜、甜瓜及西瓜上。在黄瓜抗枯萎病遗传规律方面，部分学者的研究认为，黄瓜枯萎病的抗性由单显性基因控制[15-17]，同时也存在单基因显性、单基因隐性、寡基因抗性以及数量性状遗传的特点[18]。乐素菊等[19]建立黄瓜抗枯萎病遗传模型，认为其符合 Mather 的加性—显性遗传模型，抗性遗传组成成分以加性遗传为主，部分不完全正显性，显性作用的效应不等。Dong 等[20]以黄瓜抗感自交系为材料，采用主基因+多基因混合遗传模型分析，认为其遗传符合两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合遗传模型。在甜瓜方面，前人利用不同的材料针对此研究得出了不同的结果。Chikh-Rouhou等[21]对4个甜瓜品种开展了枯萎病抗性遗传研究，结果表明，其遗传是由一个复杂基因控制的多基因遗传。A.Oumouloud等[22]研究发现，甜瓜对枯萎病的抗性遗传分别由一个隐形基因和一个显性基因独立控制。Perchepied等[23]利用重组自交系进行甜瓜抗枯萎病生理小种 1,2的遗传机制研究，结果表明，其抗性属于多基因遗传。Herman等[24]认为，香瓜抗枯萎病遗传是由2个互补的隐性基因控制。由于材料的不同以及部分专化型生理小种的分化，西瓜枯萎病抗性遗传规律更为复杂。Netzer[25]、Zhang等[26]以及周凤珍等[27]的研究结果认为，西瓜枯萎病的抗病性由单显性基因控制。邹小花等[28]采用2种遗传模型分析结果显示，PI296341-FR 对西瓜枯萎病菌生理小种2的抗性遗传由主基因和微效基因共同控制，微效基因加性效应与显性效应的绝对值均高于主基因。羊杏平等[29]采用Griffing双列杂交方法Ⅱ配制组合，认为西瓜对枯萎病抗性由隐牲多基因控制，其遗传符合加性-显性模型，不同西瓜抗性材料的杂交组合表现的遗传规律不一致。其他瓜类方面，赵秀娟等[30]和刘子记等[31]开展了苦瓜抗枯萎病的遗传机制研究，但2位学者的研究结果却各不一致，分别认为苦瓜枯萎病抗性受单一显性核基因控制和2对主基因控制。此外，冬瓜枯萎病抗性是由隐性多基因控制，符合加性-显性模型，以加性效应为主，感病对抗病表现为部分显性[32]。

3 瓜类抗枯萎病分子标记与基因定位

近年来，随着分子育种技术研究的不断深入，更多的育种家开始采用分子标记辅助育种手段开展瓜类抗枯萎病育种研究，加速育种进程。利用抗枯萎病基因的已知序列或与抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记，可以快速准确地筛选抗病植株，提高抗病育种效率。

3.1 黄瓜

国内外有关黄瓜抗枯萎病分子标记辅助育种开展较多，已筛选出一系列与抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记。王亚娟[33]采用 SSR 和 AFLP技术，以抗枯萎病黄瓜亲本 Q9和感枯萎病亲本Q10的F2分离群体为试验材料，研究了与黄瓜抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记，分别找到1个与黄瓜抗枯萎病基因连锁的共显性标记（E25M70-170 bp/167 bp），1个 SSR标记（CSWCT06A）。与黄瓜抗枯萎病基因间的距离分别为8.12和5.98 cM。张海霞等[34]和张海英等[35]以 WI2757和津研 2号及 F2代为试材，运用RAPD和AFLP标记技术，基于BSA分析方法获得了与WIS2757抗黄瓜枯萎病基因连锁的RAPD和AFLP标记，遗传距离为14和7 cM。另外，Vakalounakis[36]研究发现，黄瓜抗枯萎病基因与抗黑星病基因紧密连锁。毛爱军等[37]利用WIS2757×JY-2为遗传群体，发现抗枯萎病基因和抗黑星病基因连锁，连锁距离为17.5 cM。随着黄瓜抗枯萎病分子育种研究的不断进步，在黄瓜枯萎病抗性基因定位方面也取得了一些进展，Zhang等[38]在不同时间开展了有关黄瓜枯萎病抗性基因的定位及分子标记开发，在位于 SSR03084-SSR17631的区域筛选出一个主要的QTL-Foc2.1，在染色体2上的遗传距离为2.4 cM。并且验证了与Foc2.1相关的SSR17631的有效性。Dong 等[20]基于BSA-seq技术，开展黄瓜抗枯萎病QTL定位，将1个主效QTL定位于2号染色体上，并且利用5对 Indel引物将其精细定位于 2号染色体上的1 248 093~1 817 308 bp，其中包含了80个候选基因。周红梅等[39]也以WIS2757×津研2号及F2分离群体为试材，通过SSR分析，获得与黄瓜枯萎病抗性基因（Foc-4）紧密连锁的SSR标记9个，将基因Foc-4定位于2号染色体上，连锁距离分别为1.0和0.9 cM。

3.2 西瓜

1999~2000年，徐勇等[40-41]运用RAPD技术，首次获得了与生理小种 1号抗性基因相关的RAPD 标记。之后进行克隆、测序，并转化为SCAR标记，初步建立了西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择技术系统。Leigh等[42]构建了西瓜抗枯萎病的连锁图谱，筛选出与生理小种1号和2号抗性相关的 RAPD 标记。随着二代高通量测序技术的发展，张屹等[43]通过BSA法，将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内，利用候选SNP位点信息，开发3个CAPS/ dCAPS标记，可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病性。李娜等[44]基于重测序技术，成功将 Fon-1基因精细定位，通过主效QTL（Fon-1）验证了枯萎病抗性基因的存在，并且新开发了与Fon-1基因紧密连锁的InDel1_fon1标记，能够快速高效地用于西瓜抗枯萎病分子标记辅助育种。张敬敬等[45]利用许勇团队开发的西瓜抗枯萎病分子标记，借助高通量分型KASP标记技术对西瓜枯萎病抗性相关基因进行了检测，成功筛选到抗枯萎病材料38份。

3.3 甜瓜

甜瓜枯萎病抗性基因及分子标记研究也取得一些进展，早在1985年，Zink[46]就报道了甜瓜中抗枯萎病的基因有3个，Fom-1、Fom-2、Fom-3。Oumouloud等[47]利用抗病和感病试材，构建 F2分离群体，运用RAPD技术筛选到3对在抗病、感病植株间存在差异的引物，并通过PCR对片段进行克隆并分析差异序列的碱基，开发出与Fom-1基因连锁的SCAR标记。王士韦[48]通过基因克隆和序列比对获得3个SNP多态性位点，在F1和F2群体中，采用CAPS和AS-PCR两种分子标记验证多态性SNP位点的有效性和可靠性，并转化为功能性分子标记，成功筛选到抗病材料，为甜瓜抗枯萎病育种提供重要的资源。杨加付等[49]从薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，通过实时荧光定量PCR分析，白啄瓜经枯萎病接种后，Fom-2基因表达明显上调，为白啄瓜抗病育种奠定了基础。Tezuka等[50]设计了很多与Fom-1基因连锁的分子标记，并且对其基因位点进行图位克隆，推测其位于 C-MRGH13和62-CAPS标记之间，间距为 137.462 bp。Oumouloud 等[51]在 Fom-1基因编码区根据单一核苷酸多态性设计了2个CAPS标记Fom-1R和Fom-1S，在甜瓜育种进程中的分子标记辅助选择方面起重要作用。Sousaraei等[52]利用标记辅助回交技术，将一个抗性基因型(Isabelle)的form-2基因导入2个感病品种，成功开发出2个功能性分子标记Fom2-R409和Fom2-S253，这2个标记比接种试验更准确、高效，可作为甜瓜抗枯萎病基因型筛选的可靠工具。

4 瓜类抗枯萎病品种选育

目前，选育抗病品种是防治枯萎病最有效，最根本的办法。黄瓜在抗枯萎病品种选育方面已经取得很大的突破，生产上高抗枯萎病的黄瓜品种主要有东北农业大学研发的东农系列（东农812、东农807、东农808等）[53-55]和天津科润黄瓜研究所培育的津优48号和津优49号，其中津优 49号的亲本是通过主要病害分子鉴定技术和田间选择相结合选育而成[56-57]。中国西瓜优势产区设施栽培品种中缺少高抗枯萎病品种[58]，近10年来，在西瓜抗病育种中重点开展了抗枯萎病育种，先后培育出了爱能5号、农科大11号等高抗枯萎病西瓜新品种[58-59]。除此之外，还有很多西瓜品种都达到了抗的水平，例如榆农系列（榆农6号、榆农10号）和新优69号、郑抗2008等[60-63]。

5 展望

瓜类枯萎病对瓜类生产造成了十分严重的危害，现有的防治措施包括化学防治、农业防治等都不能有效的防治，最经济有效的防治方法是选育抗病品种。抗病资源和抗性遗传规律是抗病育种的前提和基础。目前，国内抗病资源十分有限，尤其是高抗和免疫材料十分匮乏。除此之外，部分瓜类抗性遗传规律的不确定性，都给瓜类抗病育种带来了诸多困难。利用常规育种方法进行抗病育种耗时长、难度大，并且随着病原菌不断分化，抗病品种的抗性具有局限性；分子标记辅助育种作为一种高效的现代育种技术将成为瓜类作物抗病育种的主要技术手段。目前，黄瓜、苦瓜等已完成全基因组测序，利用新一代测序技术，开展瓜类作物的基因组学研究，可以较短时间完成瓜类作物抗枯萎病分子标记的开发及抗性基因定位，快速创制丰富瓜类抗枯萎病资源。另外，随着研究的不断深入,分子标记辅助育种将会采用更多新的标记技术，更加快速、有效地解决瓜类蔬菜抗病育种难题。