益气养阴活血中药对糖尿病视网膜病变大鼠血ET-1及VEGF含量的影响*

曹兴伟 李群英 吴榆可 方 琳 杨国琴

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最为常见和严重的并发症之一，致盲率很高，是导致糖尿病患者失明的主要眼病[1]。研究显示，糖尿病视网膜病变的新生血管形成与生长因子密切相关，血管内皮生长因子(VEGF)就是其中之一[2]。血内皮素1(ET-1)是一种血管活性多肽，可反映DR的危险程度[3]。本实验观察益气养阴活血中药方对糖尿病大鼠血清ET-1、VEGF含量及视网膜组织病理学的影响，明确益气养阴活血中药方对糖尿病视网膜病变的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SD大鼠，80只，SPF级，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2011—0003；实验动物质量合格证号：NO43004700004233；实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2010—0008。实验期间环境温度20～26℃，湿度40%～70%。

1.2 药物、试剂益气养阴活血中药方：黄芪、葛根、枸杞子、生地黄、丹参、三七、蒲黄、牛膝、茺蔚子，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供。链脲佐菌素(批号：131211，Sigma公司)取链脲佐菌素0.625 g置于250 ml量瓶中，用0.1 mol/L pH 4.0的枸橼酸缓冲液溶解；GLU测定试剂盒(批号：306529，日本和光纯药工业株式会社产品)；胰岛素酶联免疫试剂盒(批号：201409，RB公司)；高脂饲料(基础饲料59.5%，胆酸钠0.5%，猪油10%，蛋黄粉10%，蔗糖20%)购于武汉市万千佳兴生物科技有限公司；ET-1(批号：182303，美国RD公司产品);VEGF Elisa试剂盒(批号：181104，美国RD公司产品)。

1.3 主要仪器AUY分析天平，日本岛津公司产品；LABOSPECT003型自动生化分析仪，日本日立公司产品；MR-96A酶标仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。

1.4 方法

1.4.1 造模分组雄性SD大鼠80只，体质量180～220 g，每日给予高脂饲料饲喂(基础饲料59.5%，胆酸钠0.5%，猪油10%，蛋黄粉10%，蔗糖20%)，另取10只大鼠作为空白对照，给予普通饲料饲喂，连续饲喂45 d，饲喂高脂饲料动物禁食不禁水16 h，模型动物按60 mg/kg剂量一次性静脉注射链脲佐菌素，注射体积为0.1 ml/100 g，造模后4 d，采用大鼠尾静脉采血，检测血糖。选取血糖值≥16.7 mmol/L的大鼠判定为2型糖尿病大鼠动物模型，结合动物多饮、多食、多尿，高胆固醇等症状，根据血糖指标兼顾体质量随机分为5组，分别为空白对照组、模型对照4周组、12周组、给药4周组、12周组，每组10只。模型对照组、空白组灌胃给予蒸馏水，益气养阴活血方组每天上午灌服用蒸馏水稀释的益气养阴活血方，给予体积为18 g生药/kg,10 ml，分别于给药后4周，于干预治疗后第4周末，模型对照4周组及益气养阴活血方4周组进行标本采集，模型12周组和给药12周组给药12周后于第12周末用同样的方法进行标本采集。

1.4.2 标本采集实验期间观察各组大鼠的一般情况，包括毛色、精神状态、摄食、饮水、尿量、体质量及日常活动。药物干预4周和12周后，禁食6～8 h，用采血针尾静脉及穿刺心脏收集全血，以检测大鼠血清ET-1、VEGF的含量。立即摘取大鼠双眼球，一部分眼球使用19G穿刺刀穿刺前房后固定于4%多聚甲醛溶液中24 h以上，常规石蜡包埋后用于HE染色。

1.4.3 检测指标及检测方法①采用ELISA法检测给药后4周、12周血清胰岛素、ET-1、VEGF含量。②分别于给药后4周、12周取大鼠眼球，进行HE染色，数字共焦显微镜下观察大鼠视网膜组织结构，并采集图像。

2 结果

2.1 益气养阴活血方DM模型大鼠血清胰岛素的影响与空白对照组比较，造模后4周、12周大鼠血清胰岛素水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 益气养阴活血方对DM模型大鼠血清胰岛素的影响 (只，

2.2 益气养阴活血方对DM模型大鼠血清ET-1、VEGF含量的影响与空白对照组比较，造模后4周、12周大鼠血清ET-1、VEGF水平均明显升高(P<0.01或P<0.05)；益气养阴活血方给药12周能明显降低糖尿病模型大鼠血清ET-1、VEGF水平，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 益气养阴活血方对DM模型大鼠血清ET-1、VEGF含量的影响 (只，

2.3 益气养阴方对DM模型大鼠视网膜组织病理学的影响正常大鼠视网膜：内界膜清楚；神经纤维层较稀疏；神经节细胞呈单层排列，胞核较大，呈圆形或椭圆形，染色较淡排列整齐；内丛状层较厚、疏松，呈明显的网状结构；内核层由4～5层细胞构成，胞核稍大，染色稍深；糖尿病大鼠模型4周组大鼠视网膜内核层结构排列紊乱，神经节细胞层可见血管内皮细胞肿胀，管腔扩张。给药4周后可见视网膜外丛状层和内核层结构排列紊乱，神经纤维层和神经节细胞层轻度水肿，个别细胞核固缩；给药12周后视网膜外丛状层和内核层结构排列紊乱，神经纤维层和神经节细胞层无明显水肿，少量细胞核固缩。见图1。

A：空白对照组；B模型4周组；C模型12周组；D给药4周组；E给药12周组图1 益气养阴活血方对DM模型大鼠视网膜组织病理学的影响

3 讨论

糖尿病属于中医学“消渴”范畴, 其病程长、慢性并发症多、症状复杂, 临床危害很大。所致眼部并发症DR被称为“消渴目病”。现代中医根据糖尿病的发病过程，认为消渴的基本病机经历了从阴虚燥热→气阴两虚→阴阳两虚这一基本证候演变过程；气滞、痰凝、血瘀作为致病因素及病理产物始终存在于这一基本病理过程中，对糖尿病视网膜病变的发生发展起重要作用[4,5]。通过多年的临床观察，我们认为：糖尿病视网膜病变的基本病机为本虚标实，以气阴两虚为本，瘀血阻络为标。所谓“气虚”是指脾肾气虚，“阴虚”是指肝肾阴虚。由于气虚则血行乏力，阴虚则血行滞涩，因而“瘀血”在糖尿病视网膜病变的发病过程中既是最主要的病理产物又是最关键的致病因素。根据这一基本病理机制，我们采用“标本同治”原则，用益气养阴活血法治疗糖尿病视网膜病变,取得了较好的临床疗效。现代药理研究表明[6]：益气养阴类代表药物(如黄芪、葛根、枸杞子、生地黄等)以及活血养血止血类的代表药物(丹参、三七、蒲黄、牛膝等)，除了具有降血脂，降血糖、抗血栓、扩血管、抗血小板聚集、降低血液黏度、改善微循环、增加视网膜的血流量等作用外，还具有增强细胞免疫和体液免疫、抗炎、抗菌、降压、利水、消肿等作用。

现代研究显示，糖尿病视网膜病变为微血管病变，与其他糖尿病血管病变一样，血管内皮细胞损伤被认为是糖尿病微血管病变发生的主要环节。一旦发生血管内皮损伤，血管内皮细胞产生及分泌血浆内皮素(ET-1)就会增加，影响血管张力，改变血流动力学，破坏血-视网膜屏障，增加血浆成分的管壁渗透，致局部微循环功能障碍，造成一系列病理改变。视网膜血管强烈持久收缩，管腔狭窄，可诱发微血栓形成；局部毛细血管脆性和通透性增加，引起视网膜出血和渗出病变；反复的内皮细胞损伤和再生可引起血管基底膜增厚和形成微血管瘤；大片毛细血管闭塞和无灌注导致视网膜缺血、缺氧，刺激血管内皮生长因子(VEGF)释放，内皮细胞增殖，产生大量的无结构新生血管，促进DR的发展[7]。由此可见，ET-1与VEGF这2种细胞因子在DR的发生发展过程中起着极为关键的作用。针对以上发病机制，寻找一种能有效抑制ET-1与VEGF这2种细胞因子的过度表达，维持血管内皮细胞相对稳定，保护血视网膜屏障，防止DR发生或阻止DR病程进展，降低致盲率的药物，至关重要。

本实验结果表明，益气养阴活血中药，对给药12周组糖尿病大鼠血清ET-1、VEGF水平明显下调作用。视网膜组织病理学显示，益气养阴活血中药方对给药12周组糖尿病大鼠视网膜具有减轻组织水肿作用。本实验研究结果提示，益气养阴活血中药可通过下调血清VEGF及ET-1水平，预防糖尿病视网膜病变的发生和发展，无升高血清胰岛素作用，糖尿病视网膜病变运用益气养阴活血中药治疗糖尿病视网膜病变，需要长期服用，短期服用治疗效果不明显。本研究仅是益气养阴活血中药治疗糖尿病视网膜病变治疗机制的初步探索，在观察指标的选择方面尚需进一步完善，如增加血脂、视网膜组织免疫组化等指标的观察。