节律基因Per1在咽喉部鳞癌中的表达及与临床病理和预后的相关研究*

王苗，金风，李媛媛，吴伟莉，龙金华，罗秀玲，龚修云，陈潇潇

550001 贵阳，贵州医科大学临床医学院 肿瘤学教研室(王苗、金风、李媛媛)；550000 贵阳，贵州医科大学附属医院·贵州省肿瘤医院 头颈肿瘤科(金风、李媛媛、吴伟莉、龙金华、罗秀玲、龚修云、陈潇潇)

头颈部肿瘤是常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率分别占全球的第六位和第八位[1-2]，90%以上的病理类型为鳞癌，咽喉部鳞癌在头颈部肿瘤中的发病呈逐年上升趋势，尽管目前的诊疗技术不断进步，但多数患者在确诊时已属晚期或伴晚期转移，患者的预后较差[3]。Period-1(Per1)基因是机体内生理节奏调节的核心基因，在机体内参与调节机体生理节奏、调控细胞周期以及促进DNA损伤修复[4-5]等一系列的生理病理过程，并与肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，Per1基因广泛参与食管癌[6]、胆管癌[7]、子宫内膜癌[8]、胰腺癌[9]、肾上腺癌[10]和口腔癌[11]等多种恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭过程，并发挥抑癌基因的作用，但相关研究多停留在分子机制层面，结合临床数据相关的分析较少，本研究旨在探索节律基因Per1在咽喉部鳞癌中的表达及与临床病理和预后的关系，以期为咽喉部鳞癌的生存预后寻找新的生物标记物提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2015年10月至2016年9月贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科咽喉部鳞癌患者的术后病理标本15例及13例咽喉部活检患者病理证实为非肿瘤的正常组织标本；同时收集了2013年1月至2017年3月60例经病理确诊为咽喉部鳞癌患者的存档蜡块及其中的20例癌旁组织蜡块，并收集对应患者的临床病理资料，包括：年龄、性别、临床分期(AJCC第七版)、是否手术、是否化疗等。通过病历阅读和电话咨询进行随访，根据《赫尔辛基宣言》伦理原则告知患者或其家属切除的组织将用于病理学研究，所有操作规程均通过贵州省肿瘤医院伦理委员会审批。

1.2 试剂

UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、Per1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；兔抗Per1多克隆抗体、GAPDH抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔二抗购自北京中衫金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒、苏木精购自上海康朗生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷缓冲液(triethanolamine buffered saline,TBS)购自青岛捷世康生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)均购自美国Gibco公司。

1.3 实时逆转录聚合酶链反应

1)使用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒，分别提取15例咽喉部鳞癌患者的术后病理标本及13例咽喉部活检患者正常组织标本中的总RNA；2)按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书将提取的两组总RNA分别逆转录成cDNA；3)取逆转录产物cDNA为模板，利用PCR蛋白定量试剂盒以及Per1和内参照GAPDH的特异性引物进行实时定量PCR反应(表1)，所有反应均设置3个复孔，反应条件为95 ℃预变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸60 s，扩增40个循环。采用NANODROP2000实时定量PCR仪进行检测，用2-△△Ct法计算两组标本中Per1基因的mRNA表达量。

表1 实时荧光定量PCR各基因引物序列

1.4 免疫组化染色及判读标准

将60例经病理确诊为咽喉部鳞癌患者的存档蜡块及其中的20例癌旁组织蜡块切片，常规脱蜡、水化和PBS冲洗后，加入枸橼酸盐修复液放入微波炉中行抗原修复2次，每次3 min，修复后冷却至室温，加入血清放入恒温箱中封闭半小时，然后加入兔抗Per1一抗(1∶225稀释)4 ℃过夜。TBS漂洗3次，每次5 min，加入HRP标记山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，TBS漂洗3次，每次5 min，DAB显色液染色、苏木精复染、梯度酒精脱水、封片，光镜下观察，每例切片随机选取5个高倍镜视野进行结果判定。Per1蛋白主要表达于细胞质，阳性染色为棕褐色、棕黄色或淡黄色。评分采用二级计分法：1)着色阳性细胞占视野总细胞百分率(阳性细胞数≤ 5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，≥ 51%计3分)；2)按染色程度分级(无染色计为0分，淡黄色计1分，黄或棕黄色为2分，棕褐色为3分)。将两者计分相乘，将≥ 2分和0～2分分别定义为阳性表达组和阴性表达组。病理诊断结果由两名病理医师确认。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。Per1基因mRNA表达水平组间比较采用独立样本t检验。Per1基因蛋白表达与临床病理特征的关系分析采用χ2检验或Fisher精确概率法，生存分析采用Kaplan-Meier法并行Log-rank检验，Cox风险比率回归模型进行多变量生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常组织中Per1 mRNA和蛋白表达水平高于咽喉部鳞癌组织

15例咽喉部鳞癌组织和13例咽喉部正常组织的PCR检测结果(图1)显示，与正常组织相比，咽喉部鳞癌组织中Per1mRNA表达水平相对较低，差异有统计学意义(P=0.001)。从表2可知，Per1蛋白在咽喉部鳞癌组织的阳性表达率为40%(24/60)，在癌旁组织中的阳性表达率为95%(19/20)，癌旁组织的Per1蛋白表达水平显著高于癌组织(P< 0.001)。Per1蛋白在癌旁组织中主要表达于细胞核和细胞质，而在咽喉部鳞癌组织中主要表达于细胞质(图2)。

图1 Per1基因在咽喉部正常组织和咽喉部鳞癌组织中的mRNA表达水平

表2 咽喉部鳞癌组织与癌旁组织Per1蛋白表达水平

图2 Per1蛋白在咽喉部鳞癌组织和癌旁组织中免疫组化染色(×200)

2.2 咽喉部鳞癌组织中Per1蛋白及mRNA表达水平与患者临床病理特征的关系

60例咽喉部鳞癌组织蜡块均有完整的临床病理数据，其中男性49例，女性11例；患者中位年龄56岁；临床分期I～II期9例，III～IV期51例；口咽癌1例，喉癌35例，下咽癌24例；患者均行放射治疗，其中手术20例。表3显示，60例咽喉部鳞癌组织Per1蛋白表达与患者性别、年龄、临床分期、是否手术、是否化疗无相关性(P>0.05)。但图3显示，15例咽喉部鳞癌患者Per1的mRNA表达水平与肿瘤分期相关，早期患者的Per1mRNA表达水平高于晚期患者(P=0.042)。

表3 60例咽喉部鳞癌组织中Per1蛋白表达与临床病理特征的关系

图3 早期和晚期咽喉部鳞癌患者Per1的mRNA表达水平

2.3 Per1蛋白表达与咽喉部鳞癌患者预后的关系

60例咽喉部鳞癌组织蜡块均有完整的随访信息，中位随访时间42个月(17～61个月)，随访时间截止到2019年6月30日。统计学分析60例咽喉部鳞癌患者Per1蛋白阳性组和阴性组的生存率，由于部分患者存活时间不足5年，故计算3年总生存率(overall survival, OS)和无进展生存率(progression-free survival, PFS)，并用Kaplan-Meier生存曲线表示(图4)。截至2019年6月30日，共有27例患者存活，33例患者死亡，其中31例死亡与肿瘤有关，1例死于突发性脑出血，1例死于心肌梗死。Per1蛋白阳性组和阴性组患者的3年OS分别为55.2%和24.3%，PFS分别为44.1%和20.7%，差异均有统计学意义(P=0.029,P=0.006)。Cox多因素回归分析显示，临床分期及Per1蛋白表达是OS的独立预后因素(P=0.010,P=0.026)(表4)。

图4 Per1蛋白阳性组和阴性组咽喉部鳞癌患者的生存曲线

表4 咽喉部鳞癌患者影响总生存的预后多影响因素分析

3 讨 论

咽喉部鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，属于高侵袭性实体肿瘤，目前，关于头颈部肿瘤的治疗仍以手术、化疗、放疗相结合的综合治疗为主，尽管随着当前诊疗手段及技术的不断进步，该类肿瘤的生存率较前有所改善，但晚期复发率及病死率仍较高[12]，因此，积极探索影响咽喉部鳞癌患者的发病及预后因素，有望改善咽喉部鳞癌患者的预后，为咽喉部鳞癌的检测及治疗提供新的思路。Per家族基因是机体生理节奏调节的核心基因，在机体内参与了细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞凋亡等一系列生理病理过程[13]。相关研究发现，Per基因还广泛参与了多种肿瘤的增殖、迁移和侵袭过程[6-11]。Han等[7]用qPCR法检测了胆管癌细胞及非胆管癌细胞中Per1基因的表达情况，结果发现Per1在胆管癌细胞中的表达显著降低；在细胞实验中发现，Per1过表达细胞表现为细胞增殖能力显著降低；进一步在动物体内研究发现，过表达Per1后，肿瘤的生长减少，增殖、血管生成和转移减少。Orhan等[14]对16例结直肠癌手术患者的癌组织及配对的正常肠黏膜中的Per1表达水平进行了分析，结果发现，癌组织中的Per1表达水平显著低于正常肠粘膜。我们的研究同样证实了咽喉部鳞癌组织中Per1基因的表达水平较正常组织降低，并且我们发现，在局部晚期咽喉部鳞癌组织中Per1的表达水平显著低于早期，这一点与之前的Per1基因在口腔鳞癌中的研究相似，该研究表明，与早期口腔鳞癌相比，局部进展期患者的Per1基因表达水平下调，且Per1基因表达的下调可显著增加淋巴结转移的风险[15]。这在另一个学者的研究中也得到了证实，该研究表明，在SCC15口腔鳞癌细胞中过表达Per1可显著促进细胞的自噬和凋亡，同时抑制细胞的增殖和AKT/mTOR通路；而沉默Per1基因，则细胞自噬和凋亡减少，并以AKT/mTOR通路依赖的方式促进细胞增殖，从而促进口腔鳞癌的进展[16]。以上结果表明，Per1基因在咽喉部鳞癌中可能是抑癌基因，具有抑制肿瘤生成的作用。

本研究研究了Per1基因与咽喉部鳞癌患者临床病理及预后的关系，完整随访收集了60例患者的临床病理资料，采用免疫组化检测了癌及癌旁组织中Per1蛋白的表达水平，结果表明，Per1蛋白表达与患者性别、年龄、临床分期、是否手术、是否化疗无相关性(P> 0.05)；Per1蛋白阳性表达组和阴性表达组患者的3年OS分别为55.2%和24.3%，3年PFS分别为44.1%和20.7%，差异均有统计学意义(P=0.029，P=0.006)；在多因素分析中显示，临床分期及Per1表达是影响患者OS的独立预后危险因素。在此次生存分析中，我们研究的OS及PFS均低于以往大多数研究[17-19]，这可能与我们本次研究纳入的样本量较少，且患者多数以局部晚期患者为主，而且我们将未治疗完成的患者也列入了分析，最终导致分析结果有所偏差所致。

综上所述，咽喉部鳞癌是常见的恶性肿瘤，多数患者在确诊时已属晚期，临床分期及Per1表达是影响其生存预后的独立危险因素，所以早诊断、早治疗显得尤为重要，本研究显示Per1在咽喉部鳞癌组织中表达较正常组织显著降低，且Per1阳性表达组较阴性组表达生存预后更好，Per1可能成为临床咽喉部鳞癌患者预后的一个预测指标，但这仍需要扩大样本量去进一步验证。

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doi:10.1016/j.drudis.2021.01.023．