基于GEO数据库筛选狼疮性肾炎的关键基因和信号通路

刘 音，杨 涛，谢裕赛，王玉柱

1.北京市海淀医院肾内科，北京100080；2.中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳110122

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，其特征是自身抗体产生、补体激活和免疫复合物沉积。每年全球范围内SLE 的发生率在0.003%～0.232%［1］。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE患者中最常见、最严重的器官表现之一，其特征通常是血尿、蛋白尿和肾小球滤过率受损［2］。约50%的SLE 患者会发展为临床特征明显的肾脏疾病，其中11%的患者在病程5年时会发展为终末期肾脏疾病（end-stage renal disease，ESRD）［3-4］。LN 是导致SLE 患者发展至ESRD 和死亡的重要原因。LN 的初始和后续治疗主要由免疫抑制剂和糖皮质激素组成，这意味着几乎没有有效且特异性的疗法。因此，研究LN 涉及的分子机制对于LN的临床治疗具有重要意义。

LN 的病理生理机制复杂。在LN 患者的不同肾小球区室中，免疫复合物的形成、先天性免疫信号途径的激活、免疫细胞的渗透和促炎症介质可通过多种途径损害肾小球细胞［5］。尽管许多研究已经确定了LN 的某些病理机制，但其发病机制仍不清楚。

在基因组水平上追踪LN 的生物学变化是一种值得关注的策略。近年来，许多学者已经进行了基因测序技术与生物信息学分析相结合的研究，以鉴定可能与预后生物标志物有关的疾病相关基因，并在未来将其开发为治疗靶标。生物信息学分析可以在极短的时间内处理大量的样品，并提供有关疾病的有价值的信息，而且与SLE密切相关的几个基因已经确定，可以驱动研究的创新［6-7］。但是，很少有研究利用生物信息学分析来鉴定和分析LN背景下的肾脏组织。

尽管LN 会影响肾脏的所有组成部分，但肾小球是最适合研究的组织，并且与疾病的发病机制和治疗密切相关。本研究选择GEO 数据库中的肾小球组织数据集GSE32591 研究LN。应用R 语言limma 包获取GSE32591数据集中的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。使用DAVID 数据库来分析这些DEGs 的GO（Gene Ontology）注释信息，包括生物过程、细胞组分、分子功能和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） 通路。构建了蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction， PPI） 网络， 并应用Cytoscape 中MCODE 及Cytohubba 插件分析DEGs，鉴定并验证了与LN 相关的10 个枢纽基因（hub genes）。最终应用GSE99339 数据集验证了枢纽基因的显著差异表达，以期为LN的诊断和治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源及筛选

在GEO 公共数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）［8］中以“lupus nephritis”及“glomeruli”作为关键词检索，选择GSE32591 数据集作为分析数据集，GSE99339 数据集作为枢纽基因验证数据集。下载GSE32591和GSE99339数据集矩阵数据及平台注释信息。GSE32591 数据集基于GPL14663 平台，其中包含32 例LN 患者和14 例正常供体对照的肾小球组织基因表达信息；GSE99339 数据集基于GPL19184 平台，含有30 例LN 患者和8 例肾脏肿瘤切除对照的肾小球组织基因表达信息。

1.2 筛选DEGs

应用R 软件（4.0.2 版） limma 包标准化数据及筛选差异基因［9］，以|log FC|＞1 和校正后P＜0.05 为阈值筛选差异基因。分别运用R 语言ggpubr 和pheatmap 包对差异基因绘制火山图及热图。

1.3 DEGs的功能富集分析

使用GO 分析确定枢纽基因的生物过程、细胞成分和分子功能属性［10］，通过KEGG 数据库确定其通路功能［11］。DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/） 是进行基因富集分析的常用数据库［12］。应用DAVID 在线工具对筛选的差异表达枢纽基因进行GO和KEGG分析，P＜0.05为差异具有统计学意义，使用R语言ggplot包绘制柱状图及气泡图。

1.4 构建PPI网络及筛选枢纽基因

STRING 数据库常用来构建PPI 网络［13］。将DEGs 输入STRING 在线工具中，筛选combined score＞0.9 的互作蛋白。将得到的PPI 结果导入Cytoscape 软件中，通过分子复合物检测（molecular complex detection，MCODE），以degree cutoff=2、node score cutoff=0.2、k-core=2 和max.depth = 100 为标准，筛选出PPI 中最显著模块［14］。在最显著模块中应用Cytohubba 插件，按degree 算法计算出评分位于前10位的枢纽基因［15］。

1.5 枢纽基因的验证

为了进一步验证正常组织和LN 组织中上述枢纽基因的表达差异，应用GEO 数据集GSE99339 的数据，分析枢纽基因的表达水平。

2 结果

2.1 DEGs的筛选

应用limma 包对GSE32591 数据集进行数据矫正及差异分析，以|log FC|＞1 和校正后P＜0.05 为阈值，获得了367个DEGs，包括253个上调基因及114个下调基因。使用ggpubr包绘制DEGs的火山图，按照校正后P值对显著DEGs进行排序；应用pheatmap包绘制出前20个DEGs的表达热图。结果显示，IFI27、MX1、ISG20等基因在LN中显著高表达（图1）。

图1 DEGs的鉴定Fig 1 Identification of DEGs

2.2 DEGs的GO分析和KEGG信号通路分析

应用DAVID 软件对DEGs 进行GO 富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO 富集分析显示这些DEGs 主要参与病毒反应应答、对病毒的防御反应，并且参与Ⅰ型干扰素信号通路、活化中性粒细胞以及负调控病毒生命周期等生物过程；主要细胞成分位于质膜外侧、囊腔及胶原纤维（含细胞外基质）；主要分子功能与Toll 样受体结合、有机酸结合、补体结合及免疫受体活性等相关（图2A）。KEGG 通路分析显示，这些差异基因主要参与甲型流感、结核病、EB 病毒感染、金黄色葡萄球菌感染和补体途径等信号通路（图2B）。

图2 DEGs的GO分析和KEGG通路分析Fig 2 GO analysis and KEGG pathway analysis of DEGs

2.3 DEGs编码蛋白的PPI网络及枢纽基因的筛选

通过STRING 在线工具和Cytoscape 软件对367 个DEGs 进行PPI 网络分析，筛选combined score ＞0.9 的互作蛋白对。在Cytoscape中得到206个节点，831条相互作用的网络图（图3A）。在PPI 网络中，利用Cytoscape 内的MCODE 插件， 以 degree cutoff = 2、 node score cutoff = 0.2、k-core = 2 和max.depth = 100 为标准，筛选出最显著模块。最显著模块包括22 个重要节点及227 条相互作用（图3B）。对最显著模块运用cytohubba 插件，以degree 算法计算出总分排名前10 位的枢纽基因，分别是IFI6、IFI27、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM3、ISG15、ISG20、MX1、SAMHD1（图3C，表1）。

图3通过STRING和MCODE方法筛选枢纽基因Fig 3 Identification of hub genes from the DEGs by STRING and MCODE

表1 10个枢纽基因的功能Tab 1 Functions of 10 hub genes

Continued Tab

2.4 枢纽基因的验证

在GEO 数据库检索其他LN 数据集。最终选择GSE99339 数据集，分析LN 与正常对照之间这些枢纽基因的差异表达水平（图4）。在GSE99339数据集中，除了缺失IFITM3的探针信息，上述枢纽基因均明显上调。说明了枢纽基因筛选结果的可靠性。

图4 在GSE99339数据集中验证枢纽基因在LN与正常组织之间的表达差异Fig 4 Differentially expressed levels of the hub genes between LN and normal in GSE99339 datasets

3 讨论

随着生物信息学的发展，人们对寻找各种疾病枢纽基因的关注日益增加，收集到的疾病枢纽基因信息可为治疗疾病提供新的手段。我们利用基于GPL14663平台的数据集GSE32591，对32 例LN 患者的肾小球组织基因表达数据进行分析，筛选DEGs。最终筛选出367 个DEGs，其中包括253 个上调基因和114 个下调基因；再运用ggpubr 和pheatmap 包绘制火山图及差异表达显著的前20个DEGs 的表达热图。热图结果显示，IFI27、MX1、ISG20等基因在LN 中显著高表达，提示这些基因可能参与LN的疾病进展。

对DEGs的功能富集分析显示，免疫应答、感染和干扰素相关基因参与了LN 的发病过程。GO 分析和KEGG途径富集分析表明，DEGs 在病毒防御反应、质膜外侧、甲型流感、结核病、EB 病毒感染和补体途径等方面显著富集，提示了LN 疾病进展中免疫活动的增强。本研究应用Cytoscape 中MCODE 及Cytohubba 插件分析这些DEGs，鉴定了与LN 相关的最显著模块及10 个枢纽基因（IFI6、IFI27、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFITM3、ISG15、ISG20、MX1和SAMHD1）。最终，应用其他GEO 数据集（GSE99339）的数据信息，验证了上述枢纽基因显著表达的可靠性。

在枢纽基因中，干扰素家族蛋白的表达显著上调，这也验证了之前的研究结果［16-17］。干扰素是一类信号蛋白，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型；其中Ⅰ型干扰素是其最大的家族［18］。GO 分析结果也表明，Ⅰ型干扰素信号通路可能与SLE 的发病机制密切相关。SLE 的大多数枢纽基因都是Ⅰ型干扰素诱导型基因。SLE 患者显示出较高水平的Ⅰ型干扰素及Ⅰ型干扰素诱导型基因，这些基因在SLE 发病机制中起主要作用［19-20］。干扰素诱导的四肽重复序列1（IFIT1）蛋白质也属于Ⅰ型干扰素家族，在大多数SLE 人群中IFIT1mRNA 的表达明显上调［21］。IFIT1是首个鉴定为主要由干扰素-α/β诱导的细胞质和线粒体干扰素刺激基因［22］。IFIT1可调节病毒复制以及翻译、增殖、凋亡和信号转导等细胞过程［23］，可能与Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子发生相互作用，从而参与SLE免疫反应。

在本研究中，我们使用系统的生物信息学方法来分析LN 中肾小球组织表达信息。研究存在一些局限性，如GEO数据库仅提供了少量LN数据集。在后续研究中，我们将进一步收集临床数据，以作更深入的探索。

总之，本研究使用GEO 数据库筛选LN 肾小球组织的367 个DEGs 及10 个枢纽基因，其可能是LN 潜在的生物标志物。生物标志物的揭示，有助于提高临床诊断水平和开发个性化治疗方法。

参·考·文·献

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