急性痛风性关节炎患者外周血miRNA-23a表达及其与临床参数的相关性分析

孙广瀚，刘 健，万 磊，姜 辉，龙 琰，鲍丙溪，张 颖

急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)是一种主要由嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所引起的炎症性、晶体性关节炎，属于代谢性风湿病，其主要表现为反复发作的急慢性关节炎、形成痛风石、肾功能出现障碍等。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是小的非编码RNA，涉及多种生物学过程的调控，与机体免疫功能和自身免疫耐受有关。miRNA与控制基因表达相关，具有生物标志物和治疗剂的作用。研究表明miR-23a在炎症、代谢等方面以转录后的方式调节靶基因的表达，并可作为炎症负性调控因子而在原发性痛风性关节炎的炎症免疫反应过程中起到重要作用。该研究通过定量PCR检测AGA患者血浆miR-23a的表达，并分析其表达与实验室参数和患者感受参数的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料

外周血样本共40例，来源于20例AGA患者(AGA组)和20例健康人(正常组)。AGA组为随机抽样2019年6—9月间在安徽省中医药大学第一附属医院风湿免疫科收治确诊者，其中男19例，女1例，年龄17～78岁(43.65±14.57)岁，均符合2015年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟(ACR/EULAR)联合制定的诊断标准。20例正常组为同期健康体检者，年龄分布与AGA组大致匹配，排除心血管、肿瘤以及其他自身免疫性疾病，其中男10例，女10例，年龄18～72岁(36.40±14.82)岁。经两独立样本

t

检验两组年龄

P

=0.482，差异无统计学意义。

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol(货号：15596018)由美国Life technogies公司提供；三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇由上海苏懿化学试剂有限公司提供；DEPC-H2O(货号：D1007)由上海捷瑞生物工程有限公司提供；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(货号：E096-01A)由上海近岸蛋白质科技有限公司提供；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(货号：K1622)、PIKO Plate Illuminator(型号：10212432C)由美国Thermo Scientific公司提供；hsa-miR-23a-5p miRNA qPCR Detection Primer Set(货号：BK1010T0004496)由南通百奥迈科生物技术有限公司提供。普通PCR仪(型号：K960)由杭州晶格科学仪器有限公司提供；高速台式冷冻离心机(型号：JW-3021HR)由合肥嘉文仪器装备有限公司提供；荧光定量PCR仪(型号：PIKOREAL 96)由美国Thermo Scientific提供；微孔板迷你离心机(型号：MINI-P25)由杭州奥盛仪器有限公司提供。

1.3 实时荧光定量PCR实验

使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。首先在0.2 ml EP管中，去除基因组DNA反应，PCR仪上42 ℃加热2 min，立即冰浴1 min。在上述EP管中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl、RT Primer Mix 1.0 μl、RNase Free dHO 4.0 μl、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 4.0 μl。在PCR仪进行加热，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。取出上述反应液，即为cDNA，-80 ℃保存备用。最后取出cDNA作为荧光定量的模板，进行荧光定量PCR反应。以β-actin作为参照进行计算，计算使用2方法执行。

1.4 实验室参数

炎症参数：超敏C-反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、α1-酸性糖蛋白(α1-acidglycoprotein, AAG)；免疫指标：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3(complement 3，C3)、补体C4(complement 4，C4)、尿酸(uric acid, UA)；代谢指标：总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)。

1.5 量表评分方法

全部患者均进行焦虑自评量表(self-rating anxiety scale,SAS)、抑郁自评量表(selfrating depression scale,SDS)、生活质量量表(the MOS item short from health survey, SF-36)的调查。由本课题小组成员在病房当面询问，填入纸质问卷，最后由本课题小组成员电脑录入统计。

2 结果

2.1 实验室参数聚类分析

不同实验室参数的不同患者的聚类分析结果见图1。将实验室参数共聚为2类：UA、AAG为聚1类，HDL-C、LDL-C、Hcy、ESR、TG、C3、C4、IgM、IgG、IgA、hs-CRP、TC为聚2类。热图其颜色表示实验室参数数值大小，数值越大颜色越深(红色10.00为上调，蓝色0.00为下调)，其中UA表达最为显著，其次是AAG。每行表示实验室参数在不同患者中的数值情况，每列表示每位患者标本号情况。

图1 实验室参数聚类分析

2.2 外周血miR-23a表达检测特异性分析

外周血标本提取的miRNA经反转录成cDNA后，采用定量PCR检测。miR-23a及U6基因是内参基因定量PCR的熔解曲线为单峰。横坐标为熔解温度，纵坐标为相对荧光单位。见图2。

图2 外周血miR-23a实时荧光定量PCR的熔解曲线

2.3 miR-23a在AGA组、正常组外周血中的相对表达量

AGA组(1.24±0.36)miR-23a在外周血中的相对表达量与正常组(0.41±0.11)相比较高，差异有统计学意义(

t

=-9.82，

P

<0.05)。

2.4 外周血中miR-23a表达水平与实验室参数的相关性分析

外周血中miR-23a表达水平与HDL-C、LDL-C、TG呈正相关(

P

<0.05)，与其余项相关性无统计学意义。见表1。

表1 外周血中miR-23a表达水平与实验室参数的相关性分析

2.5 患者生活质量各维度积分与外周血中miR-23a表达水平相关性分析

通过相关性分析得出，生理机能、生理职能、躯体疼痛、一般健康、精力、社会功能、情感职能、焦虑、抑郁与外周血中miR-23a表达水平相关系数值分别为：

r

=-0.392，

P

=0.087；

r

=-0.257，

P

=0.275；

r

=-0.217，

P

=0.357；

r

=-0.349，

P

=0.131；

r

=-0.182，

P

=0.442；

r

=-0.291，

P

=0.213；

r

=-0.47，

P

=0.038；

r

=-0.386，

P

=0.093；

r

=-0.251，

P

=0.286。其中外周血中miR-23a表达水平与情感职能呈负相关(

P

<0.05)，与其余项相关性无统计学意义。

3 讨论

AGA是一种单钠尿酸盐沉积关节所致的晶体相关性关节病，属于代谢性风湿病范畴，近年来我国AGA发病率明显上升。有研究表明，AGA患者血浆中表达上调的为miR-3146、miR-4449和miR-4654，表达下调的为miR-451a、miR-223-3p和miR-22-3p等，且部分miRNA已被证实为脂质代谢的调节因子。miR-23a在癌症方面研究的较多，其表达与靶基因X连锁的凋亡抑制蛋白的表达呈负相关，可以作为非小细胞肺癌早期诊断的潜在生物标志物，是胃癌的癌基因(在临床胃癌组织中表达上调)。在调节炎症方面，miR-23a可以通过直接炎性体轴导致神经性疼痛，在体内和体外研究中改善了败血症诱导的肺损伤，还可以通过抑制自噬/苄氯素1调节因子1基因调节成纤维细胞自噬活性参与皮肤光老化进程。

本研究表明AGA患者外周血中miR-23a表达水平均高于正常组，说明外周血中miR-23a表达上调可能是参与AGA的发生发展。并且通过相关性分析，外周血中miR-23a表达水平与HDL-C、LDL-C、TG呈正相关(

P

<0.05)。HDL-C、LDL-C、TG同属于代谢指标，而痛风主要诱因就是进食肥甘厚味导致患者不能正常代谢。并且足够的证据可表明尿酸和脂质代谢之间的关系，有研究推测脂肪组织使大量的游离脂肪酸进入肝脏, 加速了嘌呤合成途径中5′-磷酸戊糖的活化导致尿酸相对增加，从而导致痛风急性发作。同时在成脂分化中，miR-23a与3T3-L1脂肪细胞中的脂质蓄积和甘油三酸酯含量有密切联系，这提示miR-23a参与脂肪的转录。

随着医学模式的转变, 人们开始重视生存质量的研究，医师也不仅仅着眼于疾病的发展，而且重视疾病对患者感受的影响。AGA长期反复发作常困扰患者，影响患者的生活，对患者的心理也产生严重的影响。可以借助SF-36量表应用于评价AGA患者生命质量和临床效果，根据该研究通过相关性分析也反映了患者外周血中miR-23a表达水平与情感职能呈负相关，反映出miR-23a表达越高，情感职能表达越低，miR-23a表达上升可能导致患者情感职能的受到限制。

综上所述，miR-23a表达上调可能反映AGA的疾病进展和患者预后的过程，并且miR-23a可能与代谢指标、情感职能相关。代谢指标尤其是血脂异常是AGA发病的重要机制。这些结果进一步提示miR-23a表达上调可能通过代谢途径参与AGA的发病过程，其作用机制有待于进一步探讨。