PI3K/AKT通路与TRPC6通道在Ang Ⅱ诱导足细胞损伤中的相互作用

王先鹤,吴 慢,邓 芳，2,高 慧

众所周知，足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分，其结构的损伤和功能的改变都会影响肾小球滤过膜的通透性。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在维持肾脏生理功能及肾脏疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是RAS的主要效应分子，在足细胞损伤以及蛋白尿的发生过程中发挥主要作用。足细胞表达的瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel protein 6, TRPC6)是一种非选择性阳离子通道，属于足细胞裂孔膜蛋白的一种。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)信号通路是足细胞肌动蛋白细胞骨架动力学的重要调节剂，该信号通路的激活，是维持足细胞功能完整性的重要组成部分。该研究旨在进一步探讨PI3K/AKT信号通路与TRPC6通道在Ang Ⅱ诱导的肾小球足细胞损伤中的相互作用，为肾小球疾病的诊治和用药新靶点的研究提供新的思路及依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小鼠足细胞MPC5细胞株购自北京北纳创联生物技术研究院；DMEM低糖培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自以色列BI公司；Ang Ⅱ购自美国Sigma公司；氯沙坦(货号：ab120997)、PI3K/AKT通路抑制剂(货号：LY294002)、TRPC6通道阻滞剂(货号：SKF96365)、兔抗磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)抗体购自英国Abcam公司；兔抗AKT、TRPC6抗体购自美国CST公司；兔抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司；增强化学发光(ECL)试剂盒购自上海Tanon公司；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒购自日本 Takara公司；实时荧光PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司)；Hoechst 33258染色试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司。

1.2 方法

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足细胞的培养 将MPC5足细胞置于含1%的青链霉素、10%胎牛血清的DEME低糖培养基中，于37 ℃、5%CO培养箱中进行培养，每2 d换液1次，待培养瓶中细胞增殖至80%左右时接种到6孔板或12孔板中，使每孔细胞数量达到80%后用于进一步实验。

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2

实验分组 根据实验目的将足细胞进行分组：① 空白对照组,空白处理。② Ang Ⅱ组：加入Ang Ⅱ，使其浓度保持在1 μmol/L。③ Ang Ⅱ+氯沙坦组：加入Ang Ⅱ和氯沙坦,使其浓度均保持在1 μmol/L。④ 氯沙坦组：加入氯沙坦，使其浓度保持在1 μmol/L。⑤ Ang Ⅱ+LY294002组:加入Ang Ⅱ和LY294002，使其浓度分别保持在1 μmol/L和10 μmol/L。⑥ LY294002组: 加入LY294002，使其浓度保持在10 μmol/L。⑦ Ang Ⅱ+SKF96365组：加入Ang Ⅱ和SKF96365，使其浓度分别保持在1 μmol/L和40 μmol/L。⑧ SKF96365组：加入SKF96365,使其浓度保持在40 μmol/L。将上述分组细胞置于培养箱继续培养24 h后进行试验。

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qRT

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PCR反应 采用TRIzol Reagent试剂(1 ml/孔)提取各组足细胞中的总RNA，并以提取的RNA样本为模板反转录为cDNA。采用SYBR Green法对cDNA样品进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95 ℃预变性10 min后进入循环；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，扩增40个循环；每组设3个复孔，采用2法分析相对表达量。反应引物合成序列为：β-actin，(F) 5′-CATCCTCATGAAGATCCTGACC-3′，(R)5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′；TRPC6，(F)5′-CTTCC TGGCTCTCATATACTGG-3′，(R)5′-TGTGCTACAAACTTCATGAACG-3′。

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2

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4

Western blot实验 采用Western blot测定足细胞中AKT、p-AKT、TRPC6蛋白质表达的变化。将细胞培养板置于冰上，PBS清洗后，收集细胞并且提取足细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白的浓度，按照蛋白定量的结果上样，经过10% SDS-PAGE凝胶电泳，恒定电流转至NC膜上，然后放入5%脱脂牛奶室温封闭2 h，经TBST洗膜，放入一抗AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、TRPC6(1 ∶1 000)中4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，室温下孵育羊抗兔二抗(1 ∶5 000)2 h，再次TBST洗膜后，加入ECL显影液进行显色曝光，通过化学发光检测系统曝光记录图片并分析条带灰度值。以β-actin为内参照。

1

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5

Hoechst 33258染色法 采用Hoechst 33258染色法检测足细胞凋亡情况。将足细胞接种于放有玻片的12孔板中，待细胞接种24 h后，去除培养液，用PBS洗涤3遍。室温下用4%多聚甲醛固定细胞5 min，PBS洗涤3次。随后加入适量Hoechst 33258染色液覆盖玻片，置于37 ℃孵箱孵育20 min后，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗涤3次。最后进行封片，在荧光显微镜下观察。当细胞发生凋亡时，在荧光显微镜下观察会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

2 结果

2.1 Ang Ⅱ及SKF96365加药处理后对足细胞TRPC6蛋白及PI3K/AKT通路的影响

通过qRT-PCR检测各组细胞TRPC6 mRNA表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的TRPC6 mRNA表达增多(

F

=25.460，

P

<0.01)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+SKF96365组的TRPC6 mRNA表达减少(

F

=16.431,

P

<0.01)，差异有统计学意义，见图1。Western blot测定各组细胞TRPC6、AKT、p-AKT蛋白表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的TRPC6蛋白表达增多(

F

=18.750，

P

<0.05)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+SKF96365组TRPC6的蛋白表达减少(

F

=13.596,

P

<0.01)，差异有统计学意义。各组细胞AKT的表达差异无统计学意义。与空白对照组相比，Ang Ⅱ组AKT的磷酸化水平降低(

F

=15.610,

P

<0.01)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+SKF96365组AKT的磷酸化水平升高(

F

=33.839,

P

<0.05)，差异均有统计学意义，见图2。

图1 各组足细胞TRPC6 mRNA表达量

图2 各组足细胞AKT、p-AKT、TRPC6蛋白表达量

2.2 Ang Ⅱ及LY294002加药处理后对足细胞

TRPC6蛋白及PI3K/AKT通路的影响

通过qRT-PCR检测各组细胞TRPC6 mRNA表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的TRPC6 mRNA表达增多(

F

=27.011,

P

<0.01)，差异有统计学意义；与Ang Ⅱ组相比较，Ang Ⅱ+LY294002组TRPC6 mRNA表达差异无统计学意义。见图3。Western blot测定各组细胞TRPC6、AKT、p-AKT蛋白表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的TRPC6蛋白表达增加(

F

=6.699,

P

<0.05)，差异有统计学意义；与Ang Ⅱ组相比较，Ang Ⅱ+LY294002组TRPC6蛋白表达差异无统计学意义。各组细胞AKT的表达差异无统计学意义。与空白对照组相比，Ang Ⅱ组AKT的磷酸化水平降低(

F

=16.371,

P

<0.05)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+LY294002组AKT的磷酸化水平降低(

F

=33.839,

P

<0.05)，差异有统计学意义。见图4。

图3 各组足细胞TRPC6 mRNA表达量

图4 各组足细胞AKT、p-AKT、TRPC6蛋白表达量

2.3 Ang Ⅱ及氯沙坦加药处理后对足细胞TRPC6蛋白及PI3K/AKT通路的影响

通过qRT-PCR检测各组细胞TRPC6 mRNA表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组TRPC6 mRNA表达增多(

F

=7.116,

P

<0.05)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组TRPC6 mRNA表达减少(

F

=18.713,

P

<0.05)，差异有统计学意义。见图5。Western blot测定各组细胞TRPC6、AKT、p-AKT蛋白表达量，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的TRPC6蛋白表达增多(

F

=18.001,

P

<0.01)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组的TRPC6蛋白表达减少(

F

=43.204,

P

<0.01)，差异均有统计学意义。各组细胞AKT的表达差异无统计学意义。与空白对照组相比，Ang Ⅱ组AKT的磷酸化水平降低(

F

=23.570,

P

<0.01)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组AKT的磷酸化水平升高(

F

=25.975,

P

<0.01)，差异有统计学意义。见图6。

图5 各组足细胞TRPC6 mRNA表达

图6 各组足细胞AKT、p-AKT、TRPC6蛋白表达

2.4 Ang Ⅱ及SKF96365、LY294002、氯沙坦加药处理后对足细胞凋亡的影响

通过Hoechst 33258染色法进行检测各组细胞凋亡情况，图中细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染的细胞为凋亡细胞，统计各组细胞凋亡率，结果显示：与空白对照组相比，Ang Ⅱ组的细胞凋亡增多(

F

=496.2，

P

<0.05)；与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+ SKF96365组的细胞凋亡减少(

F

=506.3，

P

<0.05)，差异均有统计学意义。与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+LY294002组的细胞凋亡增多(

F

=1 261.063，

P

<0.05)，差异均有统计学意义。与Ang Ⅱ组相比，Ang Ⅱ+氯沙坦组的细胞凋亡减少(

F

=560.184，

P

<0.05)，差异均有统计学意义。见图7。

图7 各组足细胞的凋亡情况 Hoechst 33258染色 ×400

3 讨论

肾小球滤过屏障由内皮细胞、基底膜和足细胞构成，足细胞的结构与功能的正常对于肾小球滤过作用非常重要。在肾脏损伤的疾病当中，肾小球的损伤最为突出，而足细胞的损伤又是肾小球损伤的中心环节，因此研究肾小球足细胞的损伤机制显得尤为重要。有研究表明过敏性紫癜性肾炎患儿发病过程中存在足细胞损伤与脱落,且疾病活动期足细胞脱落明显增加。作为RAS的主要效应分子之一，Ang Ⅱ在正常的肾脏稳态维持中起着重要的作用。Ang Ⅱ的异常分泌与肾脏疾病的发展有关。研究报道，Ang Ⅱ可促进足细胞损伤。李涛 等研究表明过敏性紫癜性肾炎患儿尿中血管紧张素原水平显著增高，提示肾内RAS可能参与了过敏性紫癜性肾炎的发病。以上研究表明Ang Ⅱ水平的升高会损伤足细胞，本研究结果也支持此观点。

TRPC6通道蛋白被证实属于足细胞裂孔膜蛋白之一并指出Ang Ⅱ通过作用于TRPC6通道蛋白参与足细胞细胞骨架的重构。有研究指出，TRPC6与Podocin、Nephrin、ACTN4及CD2AP等多种足细胞裂孔膜蛋白相互作用，共同维系肾小球足细胞的结构及功能。再结合本研究，推测Ang Ⅱ主要通过Ang Ⅱ受体1激活TRPC6通道蛋白的表达，改变足细胞结构，从而导致足细胞凋亡。

研究表明，PI3K/AKT信号通路与肾脏疾病有关，PI3K/AKT信号通路的激活可以抑制肾细胞凋亡并阻止间质纤维化的形成。AKT被PI3K激活，而PI3K /AKT信号通路在抗足细胞凋亡中起着至关重要的作用。本实验结果显示，加入Ang Ⅱ处理后，AKT磷酸化水平降低且细胞凋亡率增加，与Wang et al研究结果相一致。结果说明，TRPC6通道蛋白与PI3K/AKT信号通路在Ang Ⅱ致足细胞的凋亡过程中均发挥重要作用。

本实验采用TRPC6通道阻滞剂SKF96365阻断TRPC6通道蛋白的活化，研究TRPC6通道对于PI3K/AKT信号通路的影响；采用PI3K/AKT 通路抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT信号通路的激活，研究PI3K/AKT 信号通路对TRPC6通道的影响。研究结果显示，Ang Ⅱ+ SKF96365组与Ang Ⅱ相比较，TRPC6 mRNA和蛋白的表达减少，而AKT的磷酸化水平却相对增加，并且细胞凋亡相对减少；这说明采用TRPC6通道阻滞剂阻断TRPC6通道蛋白可以增加PI3K/AKT信号通路的激活，从而减少细胞凋亡。从Ang Ⅱ+ LY294002组与Ang Ⅱ相比较可以看出，加入LY294002处理后，足细胞TRPC6 mRNA和蛋白的变化差异无统计学意义，但细胞凋亡依然增多，说明抑制PI3K/AKT信号通路的激活可以导致足细胞凋亡增加，但PI3K/AKT信号通路的变化对TRPC6通道蛋白未见影响。以上结果表明，Ang Ⅱ可能通过激活TRPC6通道进而抑制PI3K/AKT通路的激活而导致足细胞损伤。并且，本实验通过采用氯沙坦阻断Ang Ⅱ受体1，结果显示AKT 磷酸化水平升高，TRPC6的表达下降，而足细胞凋亡相对减少，进一步说明了Ang Ⅱ激活TRPC6通道进而抑制PI3K/AKT通路的激活而导致足细胞损伤的过程中主要是通过与Ang Ⅱ受体1的结合而发挥作用。而对于在Ang Ⅱ通过活化TRPC6通道调控PI3K/AKT信号通路影响足细胞凋亡的过程中其下游具体有哪些因素的参与，有待后续的研究进行探讨。

综上所述，Ang Ⅱ激活TRPC6通道导致足细胞损伤的过程中，可能是通过进一步抑制PI3K/AKT通路激活实现的。阻断TRPC6通道的活化，有利于PI3K/AKT信号通路的激活，进而减少足细胞凋亡从而起到保护足细胞的调控作用。