miR-223在甲型流感病毒诱导的肺上皮细胞炎症中的作用机制

刘翠翠，尚立群，段进进，陈瑞琳，张永庆，杨淑梅

NOD样受体蛋白(NOD-like receptor protein，NLRP)家族是NLR的重要成员，其中NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前体(pro-cysteine-aspartic acid protease 1，Pro-Caspase-1)组装成的多蛋白复合体，可将Pro-Caspase-1剪切为有活性的Caspase-1，进而剪切白细胞介素前体(pro-interleukin，Pro-IL)包括Pro-IL-1β、Pro-IL-18和Pro-IL-33形成有活性的成熟IL-1β、IL-18和IL-33，分泌至细胞外，介导炎症反应和诱导免疫病理损伤。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为20～24个核苷酸的内源小RNA，其介导的转录后调控在基因表达的控制中发挥重要作用。研究表明，微小RNA-223(microRNA-233，miR-223)能够特异性作用于

NLRP

3 mRNA的3′-UTR区，从而抑制NLRP3的翻译表达。在病毒入侵时，为了避免引起免疫反应，机体会释放miRNA抑制NLRP3炎症小体的激活。目前，关于miR-223在流感病毒引起的肺部损伤中作用的研究报道较少。该研究旨在探究miR-223对流感病毒引起的肺部损伤的作用及其机制，为临床上流感的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

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1 材料

收集甲型流感患者32例和正常受试者32例的血清样本，所有患者均知情同意，且本研究已获国家科研伦理委员会批准。正常人肺上皮细胞(bronchial epithelial cells, BEAS-2B)购自中国科学院细胞库，以及甲型流感病毒(influenza A virus, IAV，A/Puerto Rico/8/34/H1N1)(于9～11 d的可育SPF鸡蛋的尿囊内繁殖)。RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；TRIzol、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购自美国Promega公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠NLRP3、兔抗鼠Bax、兔抗鼠Caspase-3、兔抗鼠Bcl-2和鼠抗GAPDH购自美国Abcam公司；转染试剂Lipofectamine3000购自美国Invitrogen公司；PCR引物、miR-223 mimic以及阴性对照NC mimic由北京擎科生物科技有限公司设计、合成。

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2 实验方法

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细胞培养 本研究所有细胞常规培养于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml链霉素)，置于37 ℃、5% CO的细胞培养箱，隔天换液，细胞融合至80%～90%时传代，传至第3代进行后续实验。

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2

细胞处理 使用犬肾上皮细胞系MDCK来测定病毒的滴度，感染复数(MOI)为1。使用IAV病毒侵染BEAS-2B细胞，时间分别为12、24、36、48 h，测定细胞活力，后选取最适处理时间(36 h)进行后续实验。使用RT-qPCR检测不同处理组细胞中miR-223或NLRP3的表达情况。

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3

实验分组 将细胞分为未处理组、IAV组、IAV+NC mimic组、IAV+miR-223 mimic组。IAV病毒侵染的BEAS-2B细胞为IAV组；未感染IAV病毒的BEAS-2B细胞为未处理组；IAV病毒侵染BEAS-2B细胞36 h后用Lipofectamine3000将阴性对照NC mimic以及miR-223 mimic分别转染至BEAS-2B细胞中，分别为IAV+NC mimic组和IAV+miR-223 mimic组。

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4

RT-qPCR检测mRNA表达 TRIzol法提取BEAS-2B细胞中总RNA，进行反转录合成cDNA。RT-qPCR检测miR-223基因的mRNA表达，β-actin为内参。引物序列如下：miR-223正向序列为5′-ACGTTAGCTACACTTGCGTT-3′，反向序列为5′-AGTGCCGTTGCATACAAAGG-3′；β-actin正向序列为5′-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3′，反向序列为5′-AGGAATCCTTCTGACCACTGC-3′。以2法计算基因相对表达量。

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5

Western blot检测蛋白表达 消化对数生长期的BEAS-2B细胞，接种于25 cm培养瓶中，细胞融合至80%～90%时进行细胞转染。48 h后收集各组细胞，收集细胞上清液，并消化下贴壁细胞，加RIPA裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min(离心半径9.5 cm)。上清液用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白含量后，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，130 V恒压电泳2 h；湿转法将蛋白转移至PVDF膜上；室温下以含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭PVDF膜1 h，冲洗后分别与一抗孵育，4 ℃过夜；TBST清洗膜8 min，重复4次，加相应的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗，室温孵育2 h；TBST重复清洗膜4次，ECL试剂盒检测蛋白表达。

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细胞活力的检测 将各组细胞以1×10个/孔的密度接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO培养箱中培养24 h；向培养板中加入IAV病毒分别于37 ℃、5% CO培养箱中培养12、24、36、48 h，每个分组设3个复孔并设空白对照，每孔加入20 μl CCK-8溶液，孵育24 h；酶标仪测定450 nm处的OD值。以上实验重复3次，取平均值。

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7

细胞凋亡率的测定 将miR-223 mimic以及阴性对照NC mimic分别转染BEAS-2B细胞，于37 ℃、5% CO条件下培养48 h；将细胞以1×10个/孔的密度接种在6孔板中。根据细胞凋亡检测试剂盒的说明，用冷的PBS将细胞洗涤2次，然后用细胞凋亡检测试剂盒中的膜联蛋白V-FITC/PI染色。细胞凋亡率用流式细胞仪分析。以上实验重复3次。

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8

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的测定 将BEAS-2B细胞以1×10个/孔的密度接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO培养箱中培养24 h；收集细胞，在37 ℃下用ROS指示剂DCFH-DA(10 μmol/L)在PBS中培养30 min。使用流式细胞仪分析荧光。实验独立重复3次。

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9

miR-223与NLRP3表达量的相关性分析 绘制散点图来判断miR-223与NLRP3表达量之间的关系形态。相关系数根据样本数据计算的miR-223与NLRP3表达量之间线性关系强度的统计量。具体计算公式：

r

=

Cov

(

x

,

y

)

/σ

σ

。

2 结果

2.1 miR-223在IAV感染的患者血清和细胞中的表达

RT-qPCR结果显示，miR-223在流感患者血清中的相对表达量低于正常受试者中的表达，而

NLRP

3在流感患者中的相对表达量高于正常受试者中的表达(图1A、B)。进一步的研究表明，BEAS-2B细胞经IAV处理后，细胞活力随时间降低(图1C)。此外，用IAV处理BEAS-2B细胞后，miR-223的相对表达量降低，而

NLRP

3的相对表达量增加，且具有时间依赖性(图1D、E)。

图1 miR-223在IAV感染的患者血清和细胞中的表达

2.2 过表达miR-223对BEAS-2B细胞的炎症和氧化应激的影响

与未处理组相比，IAV处理组炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平显著升高；而将IAV处理的细胞转染miR-223 mimic后，炎症因子的水平降低(

F

=5.269，

P

=0.031 1，图2A～C)。此外，与IVA组或IVA+NC mimic组相比，IAV+miR-223 mimic组细胞内ROS水平显著降低(

F

=7.358，

P

=0.021 6，图2D)，同样细胞内NAD的水平也明显下降(

F

=15.872，

P

=0.009 5，图2E)。

图2 过表达miR-223对BEAS-2B细胞炎症和氧化应激的影响

2.3 过表达miR-223对BEAS-2B细胞凋亡的影响

当细胞经IAV处理后，细胞活力降低，而转染miR-223 mimic使IAV处理的细胞活力显著升高(

F

=3.125，

P

=0.042 3，图3A)；此外，与IAV组相比，IAV+miR-223 mimic组细胞的凋亡率降低(

F

=13.687，

P

=0.006 5，图3B)，且细胞中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达水平和凋亡相关蛋白Bax/Bal-2的比值降低(

F

=5.544，

P

=0.026 8，图3C～E)。

图3 过表达miR-223对BEAS-2B细胞凋亡的影响

2.4 过表达miR-223对NLRP3的表达以及TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响

与IAV组相比，IAV+NC mimic组NLR3P蛋白表达水平降低(

F

=6.766，

P

=0.041 1，图4A、B)；此外，与IAV组相比，IAV+NC mimic组TLR4和p-p65蛋白水平也显著下降(

F

=10.264，

P

=0.008 7，图4C、D)；通过对32个流感患者血清中miR-223和NLRP3表达量的相关性分析显示，二者表达量呈负相关(

F

=8.967，

P

=0.025 4，图4E)。

图4 过表达miR-223对NLRP3的表达以及TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响

2.5 miR-223保护IAV诱导的BEAS-2B免受损伤的调控机制

CCK-8检测结果显示，与IAV组相比，IAV+miR-223 mimic组的细胞活力增加；IAV+pcDNA3.1-TLR4组和IAV+pcDNA3.1-NLRP3组细胞活力均减弱(

F

=12.364，

P

=0.0268，图5A)，且IL-1β和ROS的表达水平增加，且细胞凋亡率升高。IAV+pcDNA3.1-NLRP3组和IAV+ miR-223 mimic+pcDNA3.1-TLR4组IL-1β、ROS水平和细胞凋亡率显著低于IAV+miR-223 mimic组，与IAV组无显著性差异(

F

=2.168，

P

=0.048 7，图5B～D)；此外，与IAV组相比，IAV+miR-223 mimic组细胞中Caspase-3的表达水平明显降低；IAV+pcDNA3.1-NLRP3组和IAV+ miR-223 mimic+pcDNA3.1-TLR4组Caspase-3的表达量显著高于IAV+miR-223 mimic组，与IAV组无显著性差异(

F

=11.257，

P

=0.013 6，图5E)。

图5 TLR4/NF-κB通路和NLRP3参与miR-223对IAV诱导的细胞损伤的保护机制

3 讨论

IAV可引起反复流行，造成人类高发病率和病死率。因此深入研究IAV的感染致病及免疫反应的机制，对研发流感病毒疫苗和抗病毒药物具有深远意义。该研究表明miR-223在IAV感染的患者血清细胞中的表达均下调，提示miR-223可能与IAV感染过程具有一定的相关性。miR-223广泛参与调控细胞的生物学过程和多种病理过程，如癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病。该研究表明过表达miR-223可抑制IAV诱导的BEAS-2B细胞炎症，这与郝俊芳 等在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞所得到的结论一致。李芸芸 等指出miR-223可显著降低心脏缺血再灌注后心机细胞的氧化应激反应。此外，miR-223还可抑制糖基化终产物诱导的人脂肪间充质干细胞凋亡。与前人的研究一致，该研究显示过表达miR-223降低IAV诱导的BEAS-2B的细胞凋亡率。以上表明，IAV感染可使miR-223表达下调，过表达miR-223可缓解 IAV诱导的BEAS-2B细胞损伤。

NLRP3炎症小体信号通路在IAV感染后引起炎症反应，并可释放炎症因子放大炎症反应。当IAV感染引起炎症小体激活时，大量的炎性因子会诱导严重肺脏免疫病理损伤，如急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征。Chung et al证实NLRP3炎症小体活化后释放的IL-1β破坏上皮细胞，并进一步诱导IL-6、TNF-α的产生，进而诱发细胞因子引起严重的急性肺损伤。越来越多的研究表明，miR-223能够抑制NLRP3炎症小体活化，进一步抑制炎症性疾病的进展。此外，激活miR-223的转录显著抑制炎性介质NLRP3的活化，并降低IL-1β产生来防止炎症损伤。Sha et al的研究表明，NLRP3在miR-223敲除小鼠表达水平升高，导致IL-1β产生和肠道炎症易感性增加。该研究显示miR-223抑制了NLRP3的活化以及TLR4/NF-κB信号通路的激活，且TLR4/NF-κB通路和NLRP3参与了miR-223对IAV诱导的细胞损伤的保护机制，表明miR-223可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路并抑制NLRP3炎症小体的活化来抑制IAV感染造成的BEAS-2B细胞损伤。