ORP8对结直肠癌DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

潘琪伟，陈韦璁，裴冬生，王庆苓

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内，结直肠癌是男性和女性的第三大癌症，每年超过69万例死亡，且该病的患者群逐渐趋向年轻化。因此，深入探讨结直肠癌发病及转移的分子机制，寻找新的治疗靶点，对治疗结直肠癌具有重要的意义。氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(oxysterol binding protein-related protein 8，ORP8)隶属于一类存在于真核细胞内的参与脂质代谢的非囊泡运输蛋白质——氧化固醇结合蛋白(oxysterol binding protein，OSBP)家族，已有研究表明，ORP8在肝癌、胃癌、非小细胞型肺癌等肿瘤中介导的信号转导在肿瘤细胞的增殖、凋亡的过程中起着重要作用，然而至今，结直肠癌患者中ORP8的表达水平及其对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力影响的研究尚无报道。该研究旨在通过从体外低表达或过表达 ORP8在结直肠癌细胞中的水平来探讨其对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人结直肠癌DLD-1细胞购自中国科学院细胞研究所。

1.2 ORP8表达质粒和ORP8 siRNA片段

针对人ORP8 mRNA的表达质粒pcDNA3.1-ORP8由本科室保存。针对人ORP8 mRNA的siRNA片段5′-GAGUGGUCUUGCAAAUUAUTT-3′及无关序列siRNA购自吉玛生物科技有限公司。

1.3 实验试剂

兔抗人细胞外蛋白调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)多克隆抗体、兔抗人磷酸化细胞外蛋白调节激酶(phosphorylated-extracellular regulated protein kinases，p-ERK1/2)多克隆抗体、兔抗人Vimentin多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗人ORP8单克隆抗体、鼠抗人p-ERK1/2单克隆抗体购自英国Abcam公司；鼠抗人β-actin、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、鼠抗人E-cadherin多克隆抗体、兔抗人N-cadherin多克隆抗体购自美国proteintech公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自美国APExBio公司；Transwell小室和Matrigel胶购自美国Corning公司；RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司；ECL购自美国Millipore公司。

1.4 实验方法

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细胞培养及分组 人结直肠癌细胞系DLD-1细胞用含10%小牛血清的DMEM于37 ℃、5% CO恒温培养箱内培养。细胞转染的操作按照Lipofectamine 2000试剂盒操作说明书进行，转染48 h后收样。将细胞分为转染空载质粒的Vector组、转染ORP8表达质粒的ORP8组、转染无关序列siRNA的siCtrl组以及转染ORP8干扰序列siRNA的siORP8组。

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Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2以及上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关分子标志物的蛋白的表达 提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，然后转印到PVDF膜，5% 脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，然后用 ECL 试剂检测目的条带。

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CCK-8检测细胞增殖能力 取对数生长期的细胞，调整细胞密度为3×10个/孔，接种至96孔板，培养24、48、72 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值(OD值)。

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Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力 取对数生长期的细胞进行细胞计数，每孔加入6×10个细胞到Transwell小室的上层，小室下层加入0.6 ml的10%血清的培养液，每组3个复孔，其中，侵袭组实验前小室内加入基质凝胶(无血清培养基 ∶Matrigel胶=9 ∶1)，置于37 ℃培养箱中过夜。迁移组培养24 h、侵袭组培养48 h后取出 Transwell 小室，用100%甲醇固定30 min，结晶紫染液染色 15 min，于倒置显微镜10倍镜下每个小室随机取10个视野拍照计数。

2 结果

2.1 ORP8表达质粒和siRNA转染DLD-1细胞后ORP8蛋白的表达

ORP8表达质粒、siRNA转染 DLD-1细胞 48 h后，采用 Western blot法检测转染效果，ORP8组ORP8表达高于Vector组，siORP8组ORP8表达低于siCtrl组，如图1中所示。

图1 ORP8过表达质粒和siRNA转染DLD-1细胞后ORP8蛋白表达情况

2.2 过表达ORP8对DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

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过表达ORP8对DLD-1细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果如图2所示，72 h 时ORP8组的细胞 OD450值低于Vector组，差异有统计学意义(72 h

t

值为5.709，

P

<0.01)。以上实验结果提示，过表达ORP8能够抑制DLD-1细胞的增殖。

图2 过表达ORP8对DLD-1细胞增殖能力的影响与Vector组比较：*P<0.05，**P<0.01

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过表达ORP8对DLD-1细胞迁移和侵袭的影响 Transwell法检测结果如图3所示，与Vector迁移组相比，ORP8迁移组DLD-1细胞的迁移细胞数量减少(

t

值为5.508，

P

<0.01)；与Vector侵袭组相比，ORP8侵袭组DLD-1细胞的侵袭细胞数量减少(

t

值为3.823，

P

<0.05)。以上实验结果提示，过表达ORP8能够抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。

图3 过表达ORP8对DLD-1细胞迁移和侵袭能力的影响 结晶紫染色 ×100

2.3 干扰ORP8对DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

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干扰ORP8对DLD-1细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果如图4所示，72 h时 siORP8组的细胞 OD450值高于siCtrl组，差异有统计学意义(72 h时

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值为7.394，

P

<0.01)。以上实验结果提示，干扰ORP8能够增强结直肠癌DLD-1细胞的增殖能力。

图4 干扰ORP8对DLD-1细胞增殖能力的影响

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干扰ORP8对DLD-1细胞迁移和侵袭的影响 Transwell法检测结果如图5所示，与siCtrl迁移组相比，siORP8迁移组DLD-1细胞的迁移细胞数量增多(

t

值为7.103，

P

<0.01)；与siCtrl侵袭组相比，siORP8侵袭组DLD-1细胞的侵袭细胞数量增多(

t

值为7.646，

P

<0.01)。以上实验结果提示，干扰ORP8能够增强DLD-1细胞的迁移和侵袭能力。

图5 干扰ORP8对DLD-1细胞迁移和侵袭能力的影响 结晶紫染色×100

2.4 过表达、干扰ORP8表达对DLD-1细胞ERK1/2、p-ERK1/2以及EMT相关分子标志物的蛋白表达情况的影响

Western blot检测结果显示：相较于Vector组，ORP8组上皮标志物 E-cadherin蛋白表达增高，间质标志物Vimentin、N-cadherin 蛋白以及p-ERK1/2蛋白表达下降；相较于siCtrl组，siORP8组上皮标志物 E-cadherin蛋白表达下降，间质标志物Vimentin、N-cadherin 蛋白以及p-ERK1/2蛋白表达增高。见图6。

图6 过表达和干扰ORP8对DLD-1细胞ERK1/2、p-ERK1/2及 EMT 相关分子标志物蛋白表达情况的影响

3 讨论

ORP8主要存在于内质网与质膜或者线粒体的膜接触位点上，其主要功能目前被证明是从内质网到细胞膜或者线粒体运输磷脂酰丝氨酸，并从细胞膜或者线粒体向内质网反方向运输磷脂酰肌醇4-磷酸，导致磷脂酰肌醇4-磷酸被磷脂酰肌醇3-磷酸酶水解。Zhong et al报道了ORP8在临床人类肝癌组织中下调，而miR-143则被报道上调ORP8的表达，ORP8可能通过介导细胞表面死亡受体的易位参与调控了原发性肝癌细胞的凋亡。Guo et al报道了过表达ORP8在体内抑制胃癌细胞的增殖和移植瘤的生长。内质网应激的诱导、Wnt信号的抑制和凋亡细胞的死亡与ORP8诱导的胃癌细胞增殖的抑制有关。最新的研究结果显示，ORP8过表达通过释放细胞色素c从线粒体进入细胞质诱导非小细胞肺癌细胞凋亡。上述研究提示ORP8在肿瘤中可能具有重要作用。本实验旨在探讨ORP8表达水平的改变对结直肠癌细胞DLD-1增殖、迁移和侵袭的影响，结果显示，过表达ORP8可抑制结直肠癌DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭的能力，反之，干扰了结直肠癌DLD-1细胞ORP8之后，癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强，提示ORP8对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力具有重要的抑制作用。

本研究显示，在与细胞迁移侵袭实验条件相同的情况下，干扰ORP8可促进上皮标志物 E-cadherin蛋白含量减少，而间质标志物 Vimentin、N-cadherin 蛋白含量增高；过表达ORP8后结果与之相反。上述研究也进一步证实了ORP8参与调控EMT，影响结直肠癌细胞迁移侵袭。

已有多项研究表明，在结直肠癌中，通过影响ERK信号传导可以调控EMT，另外也有研究表明，ERK信号通路激活与否影响着细胞的迁移能力，而且在Kattan et al的报道中，提及了ORP8与ERK信号通路的联系。本研究检测了ORP8对ERK1/2磷酸化水平的影响，结果显示，ORP8的过表达和沉默确实引起了ERK1/2磷酸化水平的变化，提示ERK信号通路在ORP8抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的过程中扮演了一个重要的角色，然而其具体机制仍有待探索。

综上所述，ORP8抑制了结直肠癌细胞DLD-1的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与抑制EMT和ERK1/2磷酸化水平有关。