微透析法研究NG2细胞功能变化对大鼠中缝核兴奋性和抑制性递质含量的影响

杨 欣，全 睿，王 慧，郭海波，滕 柳

在发育和成熟的中枢神经系统中，存在大量表达硫酸软骨素蛋白多糖的一类细胞，称为NG2细胞，其抗原属性、形态及功能等有别于其他的胶质细胞，被认为是第四类神经胶质细胞。研究表明NG2细胞在体内能够产生少突胶质细胞，还能产生原浆性星形胶质细胞；在发育和成熟的中枢神经系统的多个区域，NG2细胞和神经元之间存在独特的突触联系，可能与神经元形成一个独特的神经胶质网络。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是调节睡眠和觉醒的神经递质，主要来源于中脑中缝核, 中缝核内富含5-HT神经元，同时中缝核内也存在着神经胶质细胞群。课题组前期研究显示脑内的5-HT下降可激活中缝核星形胶质细胞，但NG2细胞功能变化对大鼠中缝核兴奋性和抑制性递质含量的影响尚不明确。因此，该研究采用微透析的方法，探讨中缝核中5-HT与NG2细胞的相互作用对γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和谷氨酸 (glutamic acid,Glu) 递质含量变化的影响。

1 材料与方法

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1 材料

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实验动物 健康SD(Sprague- Dawley)大鼠70只，雄性，体质量220～250 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK (湘) 20180010。实验动物饲养在避光、通风、电磁屏蔽状态环境中，实验温度(22±2)℃，相对湿度45%～50%，饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

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实验试剂 甲醇、乙腈(色谱纯)购自德国默克公司；无水乙酸钠、冰醋酸、四氢呋喃及其余试剂为国产分析纯；Glu标准品(100 mg，纯度≥99%)、GABA标准品(100 mg，纯度≥98%)购自上海索莱宝生物科技有限公司。

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实验仪器 液相色谱仪(型号：安捷伦1260)为安捷伦科技(杭州)有限公司产品；低温高速离心机(型号：Eppendorf 5810R)为美国Thermo公司产品；电子天平(型号：Sartori-us BSA124S )为赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品；超声波清洗器(型号：KQ5200E)为昆山市超声仪器(昆山)有限公司产品；OLABO数显三用恒温水箱(型号：HH-W420)为鑫贝西生物技术(济南)有限公司产品。

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2 实验方法

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动物分组及给药 健康雄性SD大鼠70只，随机分为正常组、对照组、NG2抗体(NG2-Ab)组、对氯基丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)组、5-羟色胺(5-HT)组、PCPA+NG2-Ab组和5-HT+NG2-Ab组。正常组不做任何处理；对照组中缝核微量注射2 μl 0.9%氯化钠溶液；NG2-Ab组中缝核微量注射NG2-Ab(2 μg/μl)2 μl；PCPA组中缝核微量注射PCPA(5 μg/μl)2 μl；5-HT组中缝核微量注射5-HT(1.25 μg/μl)2 μl；PCPA+NG2-Ab组中缝核微量注射PCPA(10 μg/μl)1 μl+ NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。5-HT+NG2-Ab组中缝核微量注射5-HT(2.5 μg/μl)1 μl+NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。

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标准品及缓冲液配制 GABA、Glu标准储备液的配制：准确称取GABA、Glu标准对照品10.00 mg，配成100 mg/ml标准液，置于40 ℃冰箱保存。邻苯二甲醛(O-Phthalaldehyde，OPA)柱前衍生: 称取0.2 g OPA，溶解于10 ml甲醇(4 ℃保存)；配置衍生剂溶液[0.5 ml OPA+2 ml 0.2 mol/L四硼酸钠缓冲液(PH=9.4)+30 μl β-巯基乙醇]，此衍生剂溶液可保持2 d。取样品或标准品10 μl，加入上述溶液100 μl，混匀，反应1 min后通过0.22 μm滤膜过滤进样。

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色谱分析条件 色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm，填料颗粒直径5 μm)，流动相A为氢呋喃-甲醇-0.05 mol/L醋酸钠(PH=6.2,5∶75∶420 V/V)，流动相B为甲醇，检测波长254 nm，柱温25 ℃，流速1.0 ml/min，进样量10 μl。梯度洗脱程序：0～6 min，流动相B的体积分数为20%；6～20 min，流动相B的体积分数从20%升至50%；20～30 min，流动相B的体积分数从50%升至100%；30～40 min，流动相B的体积分数从100%降至20%。

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微透析实验

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微透析管的埋置 动物用25%氨基甲酸乙酯(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上。按照Paxinos和Watson大鼠脑立体定位图谱确定中缝核位置(前囟后7.4 mm,旁开0 mm，深度6.4 mm)，用颅骨钻钻开一直径为2 mm的颅窗，挑破硬脑膜，在立体定位仪引导下将微透析套管插入中缝核，牙科水泥固定，术后将实验动物置于特定的环境中，单笼饲养，连续3 d腹腔注射4万U青霉素，动物恢复5 d后用于实验。实验结束后微透析插管部位注入台盼蓝染色，切片，镜下检查插管位置，检查结果表明插管位置均位于中缝核。

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微透析液的收集 实验动物每日9 a.m.进行微透析液收集。将微透析探针插入预先埋置于中缝核的套管中，微透析管膜长1 mm，外径为0.5 mm。用Ringer氏液以2 μl/min的速度灌流，每20 min收集1管透析液(40 μl)。微透析管置入60 min后正式收集微透析液，以取得稳定的基础值。实验给药前分别收集20、40 min微透析液作为实验对照，然后收集给药后第20、40、60、80、100、120 min各时相点的微透析液，用于测定Glu、GABA的含量。样本收集器的温度设定为4 ℃。收集后的微透析液样品置于-80 ℃冰箱保存。

2 结果

2.1 Glu和GABA标准工作曲线

分别吸取Glu和GABA浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/ml，加入衍生剂溶液100 μl。以峰面积为纵坐标，以相应的浓度为横坐标得到回归方程和相关系数。Glu：

Y

=2 086

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6

X

+741

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35，

r

=0.990 7；GABA：

Y

=3 040

X

-962

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05，

r

=0.990 1。

2.2 GABA、Glu定性结果

将GABA、Glu标准液在色谱仪上以10 μl进样作色谱分析。在标准液的定性分析中，根据保留时间以及紫外谱图判定该物质。定性结果见图1A、B。Glu、GABA标准品的保留时间分别为2.186、3.437 min。

图1 标准品色谱图A：Glu标准品色谱图；B：GABA标准品色谱图

2.3 中缝核注射NG2抗体对GABA 和Glu含量变化的影响

与对照组相比，NG2-Ab组GABA含量在注射后第80 min 和第100 min时间段降低，Glu含量在注射后40 min降低，差异有统计学意义(

P

<0.05)(表1、2)。结果表明中缝核NG2-Ab能影响GABA和Glu含量。

2.4 中缝核注射PCPA对GABA和Glu含量变化的影响

与对照组相比，PCPA组第80 min、第100 min和第120 min GABA含量降低，Glu含量在注射后100 min和120 min升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表1、2。

2.5 中缝核注射5-HT对GABA和Glu含量变化的影响

与对照组相比：5-HT组GABA含量在注射后第40 min、第100 min和第120 min 升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)；Glu含量在第20 min、第40 min降低，差异有统计学意义(

P

<0.05，

P

<0.01)。见表1、2。

表1 各组大鼠给药前后中缝核GABA含量的变化

3 讨论

NG2细胞广泛分布于成熟的中枢神经系统的灰质及白质中，NG2细胞不能被其它类型的胶质细胞特异标志物所标记，如星形胶质细胞、成熟少突胶质细胞、小胶质细胞的特异性标记，也不被神经元的标志物MAP2所标记。因此，NG2细胞被认为是一种新的胶质细胞类型。NG2细胞具有高度分化潜能，主要分化成参与髓鞘形成的少突胶质细胞。NG2细胞能表达离子型Glu受体和GABA受体，还能与神经元形成兴奋性和抑制性突触联系，在中枢神经系统信息传递中起到重要作用。

5-HT能神经元胞体主要集中在中缝核，发出上行纤维投射到大脑皮质、纹状体、间脑、边缘系统和小脑等脑区。中缝核群的5-HT能神经元投射到间脑和大脑皮质，主要形成慢波睡眠(SWS)，中缝核尾部的神经元则与脑桥背内侧被盖相联系，负责触发快波睡眠(FWS)。中缝核内的神经元包括5-HT能神经元和非5-HT能神经元，除神经元外，中缝核内还含有大量神经胶质细胞，它们能被外界刺激因素影响从而改变其组织形态，改变与神经元的信息交流和相互作用。

PCPA是色氨酸羟化酶不可逆抑制剂，可以有效阻止5-HT的合成，显著降低脑内的5-HT浓度。为了进一步了解中缝核NG2细胞与5-HT的功能关系，本研究向中缝核内微量注射PCPA及5-HT,分别造成5-HT含量下降和5-HT含量升高，观察GABA和Glu含量变化情况;同时注射NG2细胞抗体，观察NG2细胞兴奋性下降后5-HT含量下降或上升导致的GABA和Glu含量变化情况。研究显示单独给予PCPA造成5-HT含量下降后，能引起中缝核GABA含量下降、Glu含量上升；而同时给予PCPA和NG2细胞的抗体，中缝核GABA含量无明显变化，而Glu含量则下降，表明NG2细胞兴奋性被抑制后PCPA引起的GABA含量和Glu含量变化发生了改变，提示NG2细胞参与了5-HT含量下降导致的GABA和Glu含量的变化过程。中缝核单独微量注射5-HT导致5-HT含量上升后，GABA含量上升，Glu含量下降；同时给予5-HT和NG2-Ab后，中缝核GABA含量无明显变化，Glu含量下降；提示NG2细胞参与了5-HT上升引起的GABA含量变化。

表2 各组大鼠给药前后中缝核Glu含量的变化

研究显示NG2细胞与缺血、低氧、外伤、炎症及毒性物质作用等诸多神经系统疾病有关，NG2细胞是对中枢神经系统有害刺激迅速作出反应的细胞类型之一，其反应往往比神经元发生早，甚至早于其它神经胶质细胞，这些研究说明NG2细胞在神经病理学中发挥积极作用；NG2细胞可能与神经元构成一个独特的神经元—胶质联系网络，参与中枢神经系统多种生理和病理过程，极有可能成为中枢神经系统某些疾病治疗的靶点。本研究表明NG2细胞可以调节中缝核GABA和Glu含量，同时参与5-HT含量变化引起的GABA和Glu含量变化的调控。GABA和Glu是脑内重要的抑制性递质和兴奋性递质，在皮质兴奋和抑制调节机制中起着重要作用，但NG2通过何种途径调控GABA和Glu的含量，还需进一步研究。正常的睡眠觉醒功能依赖于皮层兴奋和抑制的动态平衡，中枢5-HT可能通过改变Glu能和GABA能神经元的兴奋性，调节神经递质释放量，调控大脑皮质兴奋和抑制过程，NG2细胞在其中发挥了重要的作用。该研究为睡眠调节药物的研发提供了实验依据。