miR-138-5p靶向TCF4调节眼葡萄膜黑色素瘤细胞的恶性生物学行为

魏 丽，连红梅，刘 鹏，刘兴华，吴书一，刘萌萌

眼葡萄膜黑色素瘤是成人常见的一种眼内原发性恶性肿瘤，起源于葡萄膜黑色素细胞，其具有易于增殖和转移的特点。在各种原发性眼部肿瘤中，葡萄膜黑色素瘤发病率居于第二位，仅次于视网膜母细胞瘤。据报道，葡萄膜黑色素瘤预后较差，常发生肝转移。葡萄膜黑色素瘤的发病机制目前尚不清楚，因此进一步探讨其发病机制、提高对其诊疗水平具有现实意义。

microRNA是一种长度大约在220 bp的非编码单链小RNA，其通过与靶信使RNA的3′非翻译区结合，在转录后水平上调控基因表达。microRNA在多种肿瘤的侵袭转移及凋亡等生物过程中都发挥着重要的作用。有研究表明，miR-138在不同癌症中异常表达，其通过靶向许多与增殖、凋亡、侵袭和迁移相关的靶基因，起到抑癌作用。然而，miR-138-5p在眼葡萄膜黑色素瘤MuM-2B细胞中的调控机制少有报道。该研究重点探讨miR-138-5p影响MuM-2B细胞的恶性生物学行为的作用机制。

1 材料与方法

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1 主要试剂和仪器

MuM-2B细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司；miR-138-5p mimic (序列：5′-GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA-3′)、mimic-NC (序列：5′-GCCGGACUAAGUGUUCACCAGCU-3′)、转录因子4(transcription factor 4,TCF4)过表达重组质粒(pcDNA-TCF4)及其对照载体(pcDNA)购自广州RiboBio公司；Lipofectamine® 2000、Superscript RNase H-逆转录酶购自美国Invitrogen公司；RNA purification system购自德国Qiagen公司；DNase-I购自瑞士Roche公司；随机六聚体购自美国Sigma-Aldrich公司；含TCF4野生型/突变型的荧光素酶报告基因质粒载体由上海Genepharm公司合成；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；Giemsa染色液、1%结晶紫、10% SDS-PAGE、羊抗兔IgG-HRP、ECL化学发光检测试剂盒购自北京索莱宝公司；10%胎牛血清购自美国Gibco公司；抗体TCF4(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)、钙黏蛋白(E-cadherin，1 ∶1 000)、神经钙黏素(N-cadherin，1 ∶1 000)、波形蛋白(Vimentin，在蛋白印迹中，1 ∶1 000；在免疫组化实验中，1 ∶200)、Ki67(1 ∶400)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF，1 ∶1 600)、SignalStain® Boost IHC检测试剂、SignalStain DAB Substrate Kit购自美国CST公司。ABI Prism 7000系统购自美国Applied Biosystems公司；SYBR Green Master Mix购自Thermo Fisher公司；Ti2-U光学显微镜购自日本Nikon公司。

1

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2 细胞分组及转染

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miR-138-5p mimic转染 将MuM-2B细胞分别为3组：对照组(control组)，miR-138-5p mimic阴性对照组(mimic-NC组)和miR-138-5p mimic组(mimic组)。严格按照制造商的使用说明，通过Lipofectamine® 2000将mimic和miR-NC分别转染到MuM-2B细胞。转染48 h后，RT-qPCR检测miR-138-5p mimic单独转染效率。

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2

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2

TCF4过表达重组质粒转染 将MuM-2B细胞分别为3组：对照组(control组)、TCF4过表达空载体组(pcDNA组)、TCF4过表达重组质粒组(pcDNA-TCF4组)。将pcDNA-TCF4pcDNA分别转染到MuM-2B细胞。转染48 h后，RT-qPCR检测TCF4单独转染效率。

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3

miR-138-5p mimic和TCF4共转染 确定miR-138-5p和TCF4分别转染成功后，将miR-138-5p mimic和pcDNA-TCF4质粒混合，进行共转染。将细胞分为4组：对照组、mimic组、pcDNA-TCF4组、miR-138-5p mimic+ pcDNA-TCF4共转染组(mimic+TCF4组)。用于后续功能实验。

1.3 RT-qPCR实验检测mRNA的相对表达量

总RNA用RNA purification system提取。用DNase-I去除基因组DNA。用Superscript RNase H-逆转录酶和随机六聚体从5 mg总RNA中制备cDNA。对于qRT-PCR，在ABI Prism 7000系统中，使用SYBR Green Master Mix和引物在优化浓度下测定基因表达。RT-qPCR用于miRNA检测的引物是根据桑格中心miRNA注册表提供的序列设计的。U6 snRNA作为内源性对照。检测基因的引物如下：TCF4，5′-CAGACGGATTGGTGTGGTC-3′(正向引物)，5′-GCACTGTCATCGGAAGGAAC-3′(反向引物)；β-actin，5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′(正向引物)，5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′(反向引物)。每个基因均生成标准曲线，扩增效率为90%～100%。通过阈值比较，确定基因表达的相对定量。所有结果均以β-actin为基准进行归一化。

1.4 双荧光素酶报告基因实验检测miR-138-5p和TCF4靶向关系

严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，将TCF4野生型(wild type，wt)/突变型载体(mutant，mut)或(和)miR-138-5p mimic转染入MuM-2B细胞中，培养48 h后，3 500 r/min离心2 min，小心吸取培养液弃去。PBS洗涤细胞后，再加入细胞裂解液，在室温下震荡 5～10 min，收集并在3 000 r/min条件下离心5 min，取上清液进行检测。

1.5 克隆形成实验检测MuM-2B细胞增殖

将对照组、mimic组、TCF4组及mimic+TCF4组的MuM-2B细胞接种于6孔板中，每孔200个细胞，连续接种7 d。废弃培养基，每个孔用PBS仔细洗2次。将集落在甲醇中固定20 min，然后用Giemsa染色液染色。统计≥50个细胞的集落数，计算集落形成效率。集落百分比=集落形成数/接种细胞数×100%。

1.6 Transwell实验检测MuM-2B细胞侵袭力

MuM-2B细胞经胰蛋白酶处理后，接种于含10%胎牛血清的培养基中，细胞数为3×10个/孔。培养24 h后，用棉签将上层残留的细胞取出。迁移后的细胞在室温下用95%乙醇固定，然后用1%结晶紫染色。在光学显微镜下观察每个孔的5个随机区域的染色情况。

1.7 Western blot实验检测TCF4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量

用10% SDS-PAGE分离细胞和肿瘤中的蛋白，并转移到PVDF膜上。在被5%脱脂牛奶封闭后，蛋白质与第一抗体(TCF4、β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)在4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化学发光检测试剂盒观察这些条带。

1.8 异种移植瘤建模检测miR-138-5p过表达对移植瘤的影响

所有实验都是根据动物实验3R原则制定的，并且得到了伦理委员会的批准。BALB/c裸鼠20只，雄性，7周龄，购自BALB/c裸鼠购自卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司，许可证号：SCXK(苏)2018-0002。恒温(25±3)℃，湿度60%，12 h/12 h光暗循环，自由获取食物和水。将小鼠分为2组：对照组、mimic组，每组10只。将转染miR-138-5p的MuM-2B细胞皮下注射至右大腿形成移植瘤。注射后第30天测定肿瘤质量。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(200 mg/kg)实施安乐死，然后收集肿瘤组织用于后续的实验。

1.9 免疫组化检测Ki67、VEGF、Vimentin阳性细胞率

脱蜡、抗原修复、脱水后，用5%正常山羊血清封闭石蜡切片1 h，与抗体(Ki67、VEGF、Vimentin)共培养过夜。切片用TBST冲洗，与SignalStain® Boost IHC检测试剂在室温下孵育30 min。切片用SignalStain DAB Substrate Kit染色，在光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 miR-138-5p mimic与pcDNA-TCF4转染效率的检测

与对照组比较，mimic组的miR-138-5p表达上调，差异有统计学意义(

F

=130.6，

P

<0.05，图1A)；与对照组比较，pcDNA-TCF4组的TCF4 mRNA表达上调(

F

=197.2,

P

<0.05，图1B)；实验结果表明转染有效。与对照组比较，mimic组的TCF4 mRNA(

F

=391.2,

P

<0.05，图1C)和蛋白(

F

=58.02,

P

<0.05，图1D)表达下调，pcDNA-TCF4组的TCF4 mRNA(

F

=391.2,

P

<0.05)和蛋白(

F

=58.02,

P

<0.05)表达上调；与pcDNA-TCF4组比较，mimic+TCF4组的TCF4 mRNA(

t

=14.12,

P

<0.05)和蛋白(

t

=6.519,

P

<0.05)表达下调。由此可见，miR-138-5p过表达可逆转TCF4的表达上调。

图1 miR-138-5p mimic与pcDNA-TCF4转染效率的检测

2.2 miR-138-5p与TCF4 的靶向关系

生物信息学软件预测miR-138-5p与TCF4靶向结合位点。如图2A所示，miR-138-5p靶向TCF4 mRNA 3′UTR的2 776 ～ 2 782位点。双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系:如图2B所示，在TCF4-wt中，与miR-NC组比较，miR-138-5p组的荧光素酶活性降低(

t

=6.719，

P

<0.05)，差异有统计学意义；而在TCF4-mut中，与miR-NC组比较，miR-138-5p组的荧光素酶活性相近，差异无统计学意义。由此验证，miR-138-5p与TCF4为靶向关系。

图2 MiR-138-5p靶向结合TCF4情况

2.3 克隆形成实验检测miR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞增殖的影响

与对照组比较，mimic组的细胞增殖下降(

F

=63.65,

P

<0.05)，而pcDNA-TCF4组的细胞增殖升高(

F

=63.65,

P

<0.05)，差异有统计学意义；与pcDNA-TCF4组比较，mimic+TCF4组的细胞增殖下降(

F

=5.664,

P

<0.05)。以上结果表明miR-138-5p过表达逆转了TCF4对MuM-2B细胞增殖的促进作用。见图3。

图3 MiR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞增殖的影响

2.4 Transwell实验检测miR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞侵袭能力的影响

与对照组比较，mimic组的侵袭细胞减少(

F

=35.76,

P

<0.05)，而pcDNA-TCF4组的侵袭细胞增加(

F

=35.76,

P

<0.05)；与pcDNA-TCF4组比较，mimic+TCF4组的侵袭细胞减少(

t

=3.809,

P

<0.05)。见图4。结果表明miR-138-5p过表达逆转了TCF4对MuM-2B细胞侵袭能力的促进作用。

图4 miR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞侵袭能力的影响

2.5 miR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞上皮-间质转化(epidermal mesenchymal transformation，EMT)的影响

Western blot检测EMT相关蛋白结果显示：如图5所示，与各对照组比较，mimic组的E-cadherin表达上调(

F

=304.2,

P

<0.05)，N-cadherin(

F

=30.91,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=39.39,

P

<0.05)表达下调；而pcDNA-TCF4组的E-cadherin(

F

=304.2,

P

<0.05)表达下调，N-cadherin(

F

=30.91,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=39.39,

P

<0.05)表达上调。与pcDNA-TCF4组比较，mimic+TCF4组的E-cadherin(

t

=6.332,

P

<0.05)表达上调，N-cadherin(

F

=4.000,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=4.341,

P

<0.05)表达下调。结果表明miR-138-5p过表达逆转了TCF4对MuM-2B细胞EMT的促进作用。

图5 miR-138-5p与TCF4对MuM-2B细胞EMT的影响

2.6 miR-138-5p 的过表达对模型小鼠体内移植瘤的影响

如图6A所示，与miR-NC组比较，mimic组的肿瘤质量减轻(

t

=5.926,

P

<0.05)。如图6B所示，与miR-NC组比较，mimic组的miR-138-5p表达上调(

t

=8.944,

P

<0.05)。如图6C、D所示，与miR-NC组比较，mimic组的TCF4 mRNA(

t

=26.84,

P

<0.05)和蛋白(

t

=7.889,

P

<0.05)表达下调。免疫组化检测组织中与增殖相关的Ki67、与EMT相关的VEGF和Vimentin的表达如图6E所示，与miR-NC组比较，mimic组的Ki67(

t

=10.79,

P

<0.05)，VEGF(

t

=4.929,

P

<0.05)和Vimentin(

t

=4.548,

P

<0.05)表达下调。上述实验均表明，miR-138-5p过表达抑制了模型小鼠体内移植瘤的生长。

图6 miR-138-5p的过表达对模型小鼠体内移植瘤的影响

3 讨论

葡萄膜黑色素瘤可以发生在眼葡萄膜的任何位置，包括虹膜、睫状体和脉络膜，其确诊依据病理学检查。按照WHO制定的统一组织学分类标准，可将葡萄膜黑色素瘤分为：梭型细胞型(A、B两型)、上皮样细胞型、混合细胞型和其它型。光学显微镜下观察，梭型细胞A型的瘤细胞是长梭形，无核仁，细胞核小，无病理性核分裂像，形态似良性；梭型细胞B型瘤细胞是胖梭型，细胞核较大，有病理性核分裂像。上皮样细胞型细胞更大，形态不规则，核仁明显，细胞核大，病理性核分裂像多见。一般认为梭型细胞的比例愈高预后越好，而上皮样细胞愈多预后愈差。

miR-138在多种癌症中异常表达，具有影响癌细胞的增殖、凋亡等生物学功能。据报道，miR-138在结直肠癌中表达水平降低，抑制细胞增殖，其与患者恶性程度负相关，与生存正相关。也有研究显示，miR-138在肺组织中的表达明显降低，体外实验表明miR-138能抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。有研究表明，miR-138-5p靶向生存素抑制了膀胱癌细胞的增殖和侵袭特性，并且miR-138-5p在一种移植瘤小鼠模型中通过负向调节生存素发挥了抗肿瘤作用。Pang et al研究表明miR-138在胃癌组织和细胞中表达下调；在体外，过表达miR-138抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭；在体内，过表达miR-138-5p抑制肿瘤生长。本研究提示miR-138-5p过表达抑制了MuM-2B细胞增殖，上调了E-cadherin的表达，上调N-cadherin和Vimentin的表达，减弱了细胞侵袭能力。以上研究表明，miR-138-5p的过表达能抑制眼葡萄膜黑色素瘤的增殖及EMT。

该研究中用生物信息学分析预测miR-138在葡萄膜黑色素瘤细胞中的可能靶基因为TCF4。TCF4是一种基本的螺旋环螺旋转录因子。大量研究表明，TCF4具有促进肿瘤生长的作用。TCF4高表达与肺癌进展呈正相关。Wang et al研究结果显示，SPINDLIN1异位表达激活Wnt/TCF4信号通路，促进卵巢癌细胞增殖。Teng et al研究认为TCF4可激活驱动蛋白家族C1(kinesin family member C1，KIFC1)，从而促进肝细胞癌的EMT，增强了细胞侵袭和增殖。本研究表明，miR-138-5p与TCF4的表达呈负相关，并通过荧光报告基因实验证实TCF4是miR-138-5p的潜在靶基因。TCF4过表达促进了MuM-2B细胞增殖和侵袭能力，并下调E-cadherin表达，上调N-cadherin和Vimentin表达，增强EMT。而过表达miR-138可逆转上述结果。在进一步的裸鼠移植瘤实验中，miR-138过表达下调了TCF4水平，抑制了增殖与侵袭相关蛋白Ki67、VEGF和Vimentin的表达，进而抑制肿瘤生长。以上研究表明， miR-138-5p通过靶向TCF4从而抑制眼葡萄膜黑色素瘤的增殖及EMT。