ACE2、TMPRSS2表达与小鼠COVID-19易感年龄及潜在靶器官关系的探讨

喻博识，陈文娟，陈小慧，王星云，余章斌，韩树萍

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)对全球人类健康构成重大威胁。COVID-19潜伏期平均5～7 d，因年龄及免疫状况差异，患者从症状出现到死亡时间为6～41 d，70岁以上患者重症率明显高于70岁以下；轻、中症患者症状轻微，以发热、乏力和干咳为主，部分患者可出现呼吸困难、低氧血症和急性呼吸窘迫综合症，发展为重症肺炎而危及生命；住院患者中因感染导致的心肌损伤(心肌炎、心肌缺血等)发生率很高，此外恶心、呕吐和腹泻等胃肠道症状也较常见；COVID-19由新型冠状肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起，SARS-CoV-2利用冠状病毒刺突糖蛋白(S蛋白)与宿主血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受体结合进入细胞，而S蛋白则需要跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2, TMPRSS2)的启动激活，TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染轴被认为是SARS-CoV-2感染宿主细胞的潜在入侵通路；SARS-CoV-2与SARS-CoV有88%的同源性，但SARS-CoV-2 S蛋白与细胞表面ACE2受体的结合能力是SARS-CoV S蛋白的10～20倍，表明SARS-CoV-2具有更强传染能力，这也是目前COVID-19全球大流行的原因之一。该研究拟检测ACE2与TMPRSS2在小鼠不同年龄、不同组织中基因和蛋白的表达，揭示COVID-19的易感年龄与潜在靶器官。

1 材料与方法

1.1 材料

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实验动物及分组 根据文献所述小鼠年龄分段标准，于南京医科大学医药实验动物中心购买不同年龄雄性C57BL/6小鼠共12只，均分为四组：新生组，1～3日龄；幼龄组，1月龄；成年组，3月龄；老龄组，18月龄。

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主要试剂与仪器 TRIzol 购自美国Invitrogen 公司；动物组织总RNA 提取试剂盒购自北京天根公司；逆转录试剂盒及PCR试剂盒购自日本TAKARA公司；ACE2、TMPRSS2和GAPDH引物序列由查询基因序列网站(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)所得，并委托南京锐真生物科技公司合成；Real-time PCR仪(美国UVP公司产品)；BCA蛋白定量试剂盒(北京碧云天生物有限公司)；ACE2兔源抗体( 稀释浓度为1 ∶1 000)、TMPRSS2兔源抗体(稀释浓度为1 ∶1 000)、GAPDH兔源抗体稀释浓度为1 ∶5 000)(美国Affinity公司)。

1.2 方法

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小鼠和人的ACE

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、TMPRSS

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蛋白氨基酸序列保守性分析 通过氨基酸序列查询网站(https://www.uniprot.org/)对小鼠和人的ACE2、TMPRSS2蛋白进行Protein BLAST蛋白氨基酸序列保守性分析。

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组织样品制备 将12只不同年龄小鼠麻醉(10%水合氯醛腹腔注射，0.05 ml/10 g)后，分别取肺、小肠和心脏组织，每份不同组织来源样品又分为3份：1份组织为50 mg用于总RNA提取及后续的RT-qPCR实验；1份组织为200 mg用于组织蛋白提取；剩余组织置于EP管-80 ℃冻存备份。

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RT-qPCR检测小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表达量 小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表达量采用RT-qPCR检测。① 总RNA提取：用TRIzol试剂从组织中分离总RNA；② 逆转录：利用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA;③ 扩增：用PCR的方法扩增cDNA;④检测:实时检测和定量扩增的产物。扩增结束后所得Ct 值采用相对定量法以GAPDH 为内参基因计算目的基因表达量，读取目的基因及内参基因的循环阈值(Ct值)，并计算目的基因与内参基因Ct值差值(ΔCt)，以2值代表目的基因mRNA表达水平，所用引物序列见表1。

表1 小鼠ACE2、TMPRSS2 和GAPDH引物序列

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Western blot检测ACE2和TMPRSS2蛋白表达量 应用RIPA 裂解液及蛋白酶抑制剂(100 ∶1)提取组织总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度并调节蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液水浴煮沸，分装后-80 ℃冰箱储存备用。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离后常规湿转法转移蛋白至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉溶液中封闭后与一抗孵育过夜。次日复温后TBST洗膜、二抗孵育、TBST再次洗涤后加入化学发光液，凝胶电泳成像系统进行图像采集。

2 结果

2.1 小鼠与人ACE2、TMPRSS2氨基酸序列保守性比较

保守性分析结果显示，小鼠与人ACE2序列一致性达82.1%，TMPRSS2序列一致性达78.4%，结果提示小鼠和人ACE2与TMPRSS2高度同源。见图1。

图1 人和小鼠来源ACE2、TMPRSS2氨基酸序列同源性分析

2.2 不同年龄小鼠同组织间ACE2、TMPRSS2 mRNA表达水平

ACE2、TMPRSS2 mRNA在肺组织中的表达结果显示：老龄组>成年组>幼龄组>新生组(

F

=81.455、42.144，

P

<0.001、

P

<0.05)，差异具有统计学意义；ACE2、TMPRSS2 mRNA在肠道组织中的表达结果显示：老龄组>成年组>幼龄组>新生组(

F

=113.187、169.555，

P

<0.001)，差异有统计学意义；ACE2、TMPRSS2 mRNA在心脏组织中的表达结果提示：成年组>幼龄组>新生组>老龄组(

F

=11.218、159.535，

P

<0.001)，差异有统计学意义。见图2。

图2 不同年龄组小鼠相同组织间ACE2、TMPRSS2 mRNA表达水平差异

2.3 同龄小鼠肺、小肠和心脏组织ACE2和TMPRSS2 mRNA表达水平

新生组小鼠肺组织ACE2、TMPRSS2 mRNA表达高于小肠和心脏组织(

F

=172.185、90.314，

P

<0.001)；幼龄组小鼠肺组织ACE2、TMPRSS2 mRNA表达高于小肠和心脏组织(

F

=211.336、224.434，

P

<0.001)；成年组小鼠肺组织ACE2、TMPRSS2 mRNA表达高于小肠和心脏组织(

F

=377.493、73.239，

P

<0.001)；老龄组小鼠肺组织ACE2和TMPRSS2 mRNA表达高于小肠和心脏组织(

F

=136.343、778.623，

P

<0.05)。见图3。

图3 同龄小鼠肺、小肠和心脏组织ACE2和TMPRSS2 mRNA表达水平

2.4 不同年龄小鼠不同组织间ACE2、TMPRSS2蛋白表达水平

不同年龄组同组织水平，小鼠肺组织和小肠组织ACE2、TMPRSS2蛋白表达随年龄增长而逐渐增高，心脏组织幼年组和成年组表达水平逐渐升高，老龄组则表达下降；同年龄维度下，肺组织表达量较高，小肠次之，心脏最低，趋势与基因水平一致。见图4。

图4 不同年龄小鼠同组织间ACE2和TMPRSS2蛋白表达水平以及同龄小鼠肺、小肠和心脏组织ACE2和TMPRSS2 蛋白表达水平

3 讨论

ACE2、TMPRSS2在特定组织的同时高表达，构成了TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染轴，这是SARS-CoV-2的潜在感染途径。ACE2是一种附着在肺、心脏、肾脏和肠道等细胞外表面(细胞膜)的酶，属于血管紧张素转换酶家族；ACE2在器官的特异性表达提示其可能在调节心血管和肾脏功能以及生育方面发挥作用。此外，ACE2作为一种跨膜蛋白，是某些冠状病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV(引起SARS的病毒)和SARS-CoV-2(导致COVID-19的病毒)进入细胞的主要结合受体。具体而言，SARS-CoV-2的S蛋白与细胞表面ACE2酶促结构域的结合会导致病毒被内吞和转运进入细胞，这种进入过程还需要宿主TMPRSS2引发S蛋白的启动，TMPRSS2属于丝氨酸蛋白酶家族，已有研究显示，S2位点的第2个精氨酸可能是TMPRSS2激活中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白所必需的，TMPRSS2激活SARS-CoV-2 S蛋白的具体机制，则有待进一步研究。有研究显示，雄激素受体拮抗药物可抑制ACE2和TMPRSS2的表达，并抑制男性COVID-19患者过度的炎症反应，此类抑制ACE2或TMPRSS2表达的药物或可治疗COVID-19。

临床研究表明，患者年龄与临床表现乃至预后存在确切相关性，且肺、小肠和心脏均可能是SARS-CoV-2靶器官。相对成人而言，大多数SARS-CoV-2感染患儿有更轻微的临床表现，无症状感染患儿也不少见。已有研究表明，COVID-19主要影响呼吸功能，绝大多数患者因呼吸衰竭死亡；此外，心脏损伤是COVID-19的一个显著特征，通常意味着更差的预后。患者还出现恶心、呕吐和腹泻等胃肠道症状，腹泻是儿童和成人最常见的胃肠道症状，呕吐在儿童中更为突出。

小鼠、人ACE2和TMPRSS2氨基酸序列保守性分析结果显示，小鼠源ACE2和TMPRSS2与人源ACE2和TMPRSS2具有高度相似性。有研究显示，ACE2 的18个氨基酸残基通过氢键、盐桥或多个范德华力与SARS-CoV-2S蛋白受体结合区域 的14 个氨基酸残基相互作用，故检测小鼠水平ACE2与TMPRSS2表达对揭示人类SARS-CoV-2易感性的年龄差异与潜在靶标具有一定参考价值。

本研究检测不同年龄小鼠同组织间ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平。实验结果表明：ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平在肺和小肠组织中，随着年龄增长逐渐升高，这与已有临床证据，即相对成人而言，大多数SARS-CoV-2感染患儿有更轻微的临床表现，较小年龄与较低病死率存在相关性这一现象基本符合。同样，检测同龄大鼠肺、小肠和心脏组织ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平，实验结果表明：肺组织表达量较高，小肠次之，心脏最低；验证了肺是SARS-CoV-2最主要的靶器官，COVID-19主要损害患者呼吸功能。

小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平的年龄差异一定程度解释了目前不同年龄人群对COVID-19的易感性差异及不同年龄患者的临床表现差异,但尚有其它干扰因素需要考虑，如一项前瞻性研究显示，男性高龄患者，伴有基础疾病等与COVID-19重症和死亡风险增加有关。小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平的组织差异解释了肺作为SARS-CoV-2入侵首要靶器官的原因。但ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表达水平高低与组织病变程度并不是绝对正相关，如心脏相对肺部和小肠低表达，而住院患者中SARS-CoV-2感染导致的心肌损伤(心肌炎/心肌缺血等)发生率很高。一项回顾性队列研究表明，老年、炎症反应和潜在的心血管并发症和SARS-CoV-2感染导致的心肌损伤有关，具体机制可能涉及感染后期的直接病毒损伤、炎性细胞因子/趋化因子介导的免疫损伤和细胞毒性免疫细胞反应，这种机体过度免疫引起的炎症风暴不仅损伤心肌，更可能导致重症患者出现多器官功能衰竭，危及生命。最新研究显示，这种多系统炎症综合征若发生在儿童COVID-19患者，会严重威胁儿童生命。

综上所述，随着C57BL/6小鼠年龄的增长，肺、小肠组织的ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白表达随之增加，提示高龄可能是SARS-CoV-2感染的独立危险因素之一；肺组织ACE2、TMPRSS2基因和蛋白相对于小肠和心脏等组织的高表达，验证了肺是SARS-CoV-2入侵机体的首要靶器官。以上研究结果，为COVID-19预防和治疗相关研究提供了新思路，ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白在不同组织的表达差异，有助提高临床医生诊断鉴别COVID-19相关并发症的敏感度，也提醒临床医生注意出院患者的随访，观察远期预后。同时住院患者中SARS-CoV-2感染导致心肌损伤的较高发生率以及儿童多系统炎症综合征等新情况的出现，凸显了COVID-19及其病原体SARS-CoV-2的复杂性，亟待进一步深入研究。