异泽兰黄素通过抑制miR-188-5p的表达抑制视网膜母细胞瘤的侵袭并诱导凋亡

夏 玉，王 维，邓铂林，高玉英，李 静

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤，典型表现为白眼或斜视。Rb的治疗是多模式的，包括化疗 (静脉内化疗和动脉内化疗)、放射治疗、手术治疗及病灶治疗包括经瞳孔热疗、冷冻治疗和激光光凝等。越来越多的证据表明，微小RNA(MicroRNA,miRNA)在肿瘤发生过程中起着抑癌基因或致癌基因的作用。研究表明miR-30、miR-let-7e、miR-21和miR-320在Rb中表达失调，是诊断Rb的生物标志物。miR-188-5p 在Rb组织中表达量上调，并抑制DNA结合抑制因子(DNA binding 4，ID4)的表达，从而加快Rb的发展进程。该文主要通过检测异泽兰黄素对miR-188-5p的表达影响及对Rb的细胞侵袭、细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

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1 细胞培养与处理

Rb Y79细胞购自中国科学院的细胞库，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)进行培养于37 ℃生长。miR-188-5p mimic和miR-NC根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen，美国Thermo Fisher Scientific公司)转染到SU-DHL-4细胞。

1.2 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物比色 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测细胞活性

在96孔板中，将Rb Y79细胞分别用不同浓度异泽兰黄素(1、2.5、5、10、20、40、100、200、300 μmol/L)处理24 h时，再用10 μl MTT染料处理细胞，然后与100 μl二甲基亚砜孵育15 min，用酶免疫分析仪在490 nm处测量吸光度。用各浓度处理组细胞吸光度值与1 μmol/L组细胞吸光度值的比值表示细胞活性。

1.3 miR-188-5p mimic转染及分组

将Y79细胞分为3组：① Control组：Y79细胞不做任何处理；② mimic-NC组：通过Lipofectamine® 2000将mimic-NC转染到Y79细胞；③ miR-188-5p mimic组(mimic转染组)：通过Lipofectamine® 2000将miR-188-5p mimic转染到Y79细胞。转染48 h后， RT-qPCR检测miR-188-5p转染效率。然后将Y79细胞分为4组， ① Control组：Y79细胞不做任何处理；② 40 μmol/L异泽兰黄素组：Y79细胞用40 μmol/L浓度的异泽兰黄素处理24 h时；③ mimic转染组：通过Lipofectamine® 2000将miR-188-5p mimic转染到Y79细胞；④ mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组：通过Lipofectamine® 2000将miR-188-5p mimic转染到Y79细胞，然后用40 μmol/L浓度的异泽兰黄素处理24 h时。

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4 Western blot

用异泽兰黄素10、20、40 μmol/L分别处理Y79细胞后，将细胞用裂解缓冲液裂解在4 ℃并以14 000 r/min离心15 min浓缩蛋白质。然后用BCA试剂盒(上海碧云天生物有限公司)测定蛋白质浓度。取20 μg总蛋白经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜在37 ℃下用1 h封闭5%的牛血清白蛋白，然后与抗E-cadherin、N-cadherin、Bax和Bcl-2在4 ℃过夜。用TBS缓冲液(含Tween-20的Tris缓冲盐溶液)洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反应1 h；洗膜后ECL曝光成像并应用quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。

1.5 总RNA提取、反转录和荧光定量

使用TRIzol从Y79细胞提取总RNA，提取的总RNA首先去除基因组中的DNA，然后进行反转录，以上步骤根据产品说明书进行操作。荧光定量检测反应体系：5 μl的SYBR Premix，各0.5 μl的上游引物和下游引物，3 μl的RNase Free dHO，1 μl的cDNA。程序：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。扩增完成后进行熔解曲线分析：95 ℃维持10 s，65 ℃处理1 s,此后从65 ℃开始，每个循环温度增加0.5 ℃，时间为1 s。miR-188-5p引物是5′-CCCTCTCTCACATCCCTTGCAT-3′ (上游)和5′-ATCCTGCAAACCCTGCATGTG-3′ (下游)。

1

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6 克隆形成试验

将Y79细胞转染miR-188-5p mimic和miR-NC进行处理，在无毒培养基中培养大约14 d。并用40 μmol/L异泽兰黄素处理转染miR-188-5p mimic Y79细胞24 h时用冷的甲醇-冰醋酸固定细胞，然后用结晶紫染色。

1

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7 流式细胞术

采用Annexin Ⅴ-荧光素(AV)和碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(美国Invitrogen公司)，流式细胞术检测不同处理组Y79细胞的凋亡率。刺激后，用PBS洗涤细胞，5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI在室温、黑暗中孵育15 min。使用FACScan流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)进行流式分析，使用FlowJo软件(美国Tree Star公司)进行数据分析。

1.8 Transwell实验

用不含血清的DMEM将接种5×10/200 μl Y79细胞在Transwell室上部,下室充满500 μl 10%FBS DMEM。孵育24 h后，将下室中的细胞固定在95%乙醇中，然后用苏木精染色。在倒置显微镜下计算进入下室的细胞数量。

2 结果

2.1 异泽兰黄素对Rb Y79细胞存活率的影响

随着异泽兰黄素浓度的增加，Rb Y79细胞活性明显下降。当异泽兰黄素浓度为5、10、20、40 μmol/L时，Rb Y79细胞活性>70%，毒性较低。因此，本研究选择异泽兰黄素10 μmol/L (低剂量组)、20 μmol/L (中剂量组)、40 μmol/L (高剂量组) 作后续研究。见图1。

图1 MTT法检测Rb Y79细胞活性

2.2 异泽兰黄素对Rb Y79细胞凋亡和迁移的影响

通过Western blot检测Bax、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin蛋白的含量，结果显示，与Control组比较，Bax/Bcl-2的比值在异泽兰黄素中剂量组(

t

=9.653,

P

<0.05)和高剂量组(

t

=15.730,

P

<0.01)中上调, 差异有统计学意义；与Control组比较，E-cadherin蛋白的表达量在异泽兰黄素中剂量组(

t

=4.750,

P

<0.05)和高剂量组(

t

=10.922,

P

<0.01)中上调, 差异有统计学意义；与Control组 比较，N-cadherin蛋白的表达量在异泽兰黄素中剂量组(

t

=9.894,

P

<0.05) 和高剂量组(

t

=13.649,

P

<0.01)中下调, 差异有统计学意义；尤其在异泽兰黄素高剂量组中蛋白表达量的变化差异更大。见图2。

图2 Western blot检测Bax、Bcl-2、E-cadheri和N-cadherin蛋白的变化

2.3 异泽兰黄素对Rb miR-188-5p表达量的影响

Y79细胞分别转染mimic-NC和miR-188-5p mimic，通过RT-qPCR检测miR-188-5p的表达量，结果显示，与Control组比较, 转染miR-188-5p mimic组中miR-188-5p的表达量上调, 差异有统计学意义(

t

=12

.

516,

P

<0.01)。 与Control组比较, 异泽兰黄素中剂量组(

t

=12.413,

P

<0.05)和高剂量组 (

t

=38.634,

P

<0.01)中Y79细胞内miR-188-5p的表达量下调，差异有统计学意义。用40 μmol/L浓度异泽兰黄素处理转染后的Y79细胞，检测结果显示，与mimic转染组比较, mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组miR-188-5p的表达量下调, 差异有统计学意义(

t

=12.603,

P

<0.01)。见图3。

图3 miR-188-5p mRNA相对表达量

2.4 异泽兰黄素抑制miR-188-5p表达量对Y79细胞增殖和凋亡影响

克隆形成试验结果显示，与Control组比较，40 μmol/L异泽兰黄素组中异泽兰黄素能抑制Y79细胞, 差异有统计学意义 (

t

=7.925,

P

<0.01)；与mimic转染组比较，在mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组中异泽兰黄素也抑制Y79细胞克隆率, 差异有统计学意义 (

t

=7.159,

P

<0.01)； 然而，与Control组比较，mimic转染组, 差异有统计学意义(

t

=6.001,

P

<0.01)。见图4A、B。流式细胞术结果表明，与Control组比较，40 μmol/L异泽兰黄素组异泽兰黄素能促进Y79细胞凋亡, 差异有统计学意义(

t

=8.831,

P

<0.01)；与mimic转染组比较，mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组中异泽兰黄素也促进Y79细胞凋亡, 差异有统计学意义(

t

=10.142,

P

<0.01)；然而，与Control组比较，mimic转染组miR-188-5p过表达抑制Y79细胞凋亡, 差异有统计学意义(

t

=3.163,

P

<0.05)。见图4C、D。

图4 Y79细胞胞增殖和凋亡的测定

2.5 异泽兰黄素抑制miR-188-5p表达量对Y79细胞侵袭的影响

Transwell检测细胞侵袭力，结果显示，与Control组比较，40 μmol/L异泽兰黄素组异泽兰黄素能抑制Y79细胞侵袭力, 差异有统计学意义(

t

=7.977,

P

<0.01)；与mimic转染组比较， mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组异泽兰黄素也抑制Y79细胞侵袭力,差异有统计学意义(

t

=6.246,

P

<0.01)。然而，与Control组比较，在mimic转染组miR-188-5p过表达促进Y79细胞侵袭力, 差异有统计学意义(

t

=7.844,

P

<0.01)。见图5A、B。Western blot检测E-cadherin和N-cadherin蛋白的含量，结果显示，与mimic组比较，mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组E-cadherin蛋白的表达量上调, 差异有统计学意义(

t

=9.827,

P

<0.05)，而与mimic组比较，mimic转染+40 μmol/L异泽兰黄素组N-cadherin蛋白的表达量下调, 差异有统计学意义(

t

=20.940,

P

<0.01)。见图5C、D。

图5 细胞侵袭力及相应蛋白的测定

3 讨论

异泽兰黄素 (5,7-二羟基-3,4,6-三甲氧基黄酮) 是一种从青蒿中提取的黄酮类化合物，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化和抗癌作用。异泽兰黄素能够抑制食管癌TE1细胞的增殖，同时还能诱导TE1细胞在G/G期细胞周期阻滞。异泽兰黄素诱导骨肉瘤U-2OS细胞G/M期的阻滞和凋亡，同时能够触发线粒体凋亡通路，抑制癌细胞的增殖。该研究显示在异泽兰黄素处理Rb Y79细胞后，Bax /Bcl-2的比值增加，同时流式细胞术检测显示细胞凋亡率增加；克隆形成试验中Y79细胞增殖下调；Transwell实验表明Y79细胞的侵袭力下调，E-cadherin蛋白的表达量上调，而N-cadherin蛋白的表达量下调。以上研究表明，异泽兰黄素能抑制Rb Y79细胞增殖、侵袭并诱导细胞凋亡。

Rb 是儿童最常见的眼内癌，在亚洲和非洲，近40%～70%的儿童死于Rb ，而在欧洲和美国，这一比例仅为3%。miRNA的异常调节也参与着Rb 的发展。有研究表明miR-221/222的过表达促进了Rb Y79细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-188-5p 在Rb 组织中表达量上调，而miR-188-5p的过表达抑制ID4的表达，从而加快Rb 的发展进程。并且已经有研究表明异泽兰黄素抑制miR-21的表达量，而miR-21通过抑制YAP1蛋白的表达促肾癌细胞凋亡和增强抗氧化作用。也有研究表明异泽兰黄素通过促进子宫颈癌细胞系HeLa和Caski细胞的凋亡和细胞周期阻滞，从而发挥抑制癌细胞增殖的作用。本研究显示异泽兰黄素抑制miR-188-5p的转录表达量，同时促进转染miR-188-5p的Y79细胞凋亡，抑制细胞增殖和侵袭。以上研究表明异泽兰黄素通过抑制miR-188-5p的表达抑制Rb 的增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。

该研究仅为体外细胞试验和机制的初步探讨，体内试验有待进一步进行研究；该研究仅仅表明异泽兰黄素抑制miR-188-5p过表达，但通过什么机制，或者靶向作用何种蛋白还有待进一步研究。