葡萄籽原花青素对糖尿病小鼠心室重构的保护作用

程雨微，王小云，查红英，凌鑫鑫，潘 铭，阮承少，王君萍，高 杉，朱德发

糖尿病是以高血糖、高血脂为特征的代谢性疾病，近年来，其发病率逐年增高并呈年轻化趋势，糖尿病诱发的脏器损伤尤其是心血管损伤是导致糖尿病患者死亡的主要原因，其病死率是非糖尿病人群心血管疾病的2～3倍，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是重要并发症之一，是导致糖尿病病人死亡的重要原因。DCM概念最早是由Rubler和Hamby发现和提出，主要表现为心脏微血管病变和心肌细胞代谢紊乱所致的心脏广泛局灶性病变。DCM早期表现为心肌顺应性降低、充盈受限为主的舒张功能不全，晚期变现为收缩功能障碍和全心衰竭。目前已达成共识，DCM是心血管终点事件的独立风险因素，其发生不依赖于高血压、冠状动脉粥样硬化等常见心血管疾病。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins，GSP)是从葡萄种子和葡萄皮中提取的一种有效抗氧化剂，具有调节血脂，抗肿瘤，调节血糖，保护心血管的作用。GSP提取物具有强氧自由基清除能力，其抗氧化活性优于其他常用的抗氧化剂，数据显示GSP抗氧化作用是维生素C的20倍，是维生素E的50倍；生物利用度也高于维生素C、E和β-胡萝卜素等抗氧化剂。目前有关GSP在体降血糖的研究报道较少，本研究拟通过腹腔注射四氧嘧啶建立1型糖尿病模型，探究GSP对糖尿病小鼠心室重构的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物和材料

SPF级昆明小鼠(

n

=70)，雄性，体质量(26±2) g，购自北京维通利华实验动物股份有限公司(No:11001119110375110，许可证号：SCXK京2016-0011)。四氧嘧啶(ALX，批号：101847561)购自美国SIGMA化学公司；GSP(批号: H27J9Z64554)购自上海源叶生物科技有限公司；二甲双胍(metformin hydrochloride tablets,MET)(批号：20190162)购自贵州天安药业股份有限公司。血糖仪(批号：ET80116RB)购自中国台湾翔国科技有限公司。

1.2 糖尿病模型的建立与分组

昆明小鼠适应性喂养3 d后，禁食24 h，自由饮水，每只小鼠按140 mg/kg剂量一次性腹腔注射四氧嘧啶制备糖尿病模型。对照组小鼠腹腔注射等量的0.9%氧化钠溶液，于注射后第5天取尾血测空腹血糖，血糖值10～25 mmoL/L为高血糖模型，即造模成功。将造模成功小鼠随机分为5组，每组12只。对照组、模型组每日给予0.9%氯化钠溶液灌胃，GSP低剂量组、GSP中剂量组、GSP高剂量组分别给予65、130、195 mg/kg的GSP灌胃给药，阳性药组给予220 mg/kg的MET灌胃给药，连续给药30 d。

1.3 空腹血糖降低和糖耐量实验

给药后每3 d取尾血测空腹血糖值至给药周期结束，每周固定时间内记录各组小鼠的饮食量和饮水量。末次给药后禁食5 h。测定血糖值，15～20 min灌胃葡萄糖2.0 g/kg，测定给葡萄糖后0.5、2 h的血糖值，观察模型组、对照组与给药组给予葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化，从而明确糖耐量的变化。

1.4 血流动力学指标测定

小鼠末次给药后禁食不禁水12 h，称体质量(body weight，BW)，10%水合氯醛(0.035 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠。然后迅速分离右颈总动脉，将预先浸泡于肝素中的聚乙烯导管插入其中，通过BL-420S转换器记录信号。待信号稳定后，将导管继续沿着右颈动脉的方向插入左心室中，记录血流动力学参数左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室压力变化最大速率(maximum rate of left ventricular pressure，±dp/dt)等血流动力学指标。

1.5 心脏重量指数(heart weight index，HWI)和肾脏重量指数(kidney weight index，KWI)的测定

血流动力学指标采集完成后，颈静脉取血，然后处死小鼠，迅速取出心脏和肾脏，剔除心脏和肾脏周围结缔组织，0.9%氯化钠溶液洗尽残血，滤纸吸干后称量全心重及肾重，并计算HWI(HWI=全心重/BW)和KWI(KWI = 肾重/BW)。

1.6 Masson染色观察心脏组织胶原变化

组织切片常规脱蜡水洗，Bouin液媒染过夜，流水冲洗至黄色消失，天青石蓝染色液滴染2～3 min，稍水洗。Mayer苏木精染色液滴染2～3 min。酸性乙醇分化数秒，流水冲洗10 min。丽春红酸性复红液5～10 min，1%磷钼酸分化10 min，苯胺蓝或光绿液染5 min，0.2%冰醋酸浸洗，各梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检。

1.7 免疫荧光检测心肌组织内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达

石蜡切片常规脱水，置柠檬酸钠抗原修复液中。3%双氧水室温孵育，PBS冲洗，QuikBlock免疫封闭液封闭30 min。轻甩封闭液，滴加eNOS一抗(1 ∶200)4 ℃孵育过夜。复温30 min后PBS冲洗。滴加二抗(1 ∶1 000)室温下进行孵育。DAPI核染3～5 min，抗荧光猝灭剂封片，避光镜检。

1.8 酶联免疫吸附法和比色法检测血清学指标

采用酶联免疫吸附法检测血清中内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、内皮性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和糖化血清蛋白的活性，比色法检测血清中一氧化氮(nitric oxide，NO),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。

1.9 Western bolt测定心脏组织eNOS、内皮素A受体(endothelin-1 A receptor, ETA)的表达

取新鲜心肌组织，加RIPA(radio-immunoprecipitation assay)裂解液(含1%苯甲基磺酰氟)冰上裂解，4 ℃离心(12 000 r/min，10 min)。收集上清液，80 ℃保存。取上清液, 以二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度。非变性eNOS通过12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，ETA通过8%的SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，漂洗 3×10 min，加入一抗(eNOS，1 ∶5 000，美国Abcam公司；ETA，1 ∶500，(武汉博士德公司)4 ℃孵育过夜。次日再漂洗PVDF膜3次，加入二抗(山羊抗兔，1 ∶10 000，上海碧云天公司)，室温孵育1 h。漂洗后ECL试剂显色。

2 结果

2.1 GSP对糖尿病小鼠动态血糖、糖耐量、糖化血清蛋白的影响

与对照组相比，造模后模型组血糖值明显升高。而经过GSP和MET治疗后，与模型组相比，各给药组血糖明显降低(图1A)，血糖曲线下面积明显减小，糖耐量值明显降低(图1B),血清糖化血清蛋白活力明显降低(图1C)，差异有统计学意义(

P

<0.05，

P

<0.01)。

图1 GSP对实验性糖尿病小鼠动态血糖水平、糖耐量和糖化血清蛋白的影响

2.2 GSP对糖尿病小鼠饮食饮水量的影响

与模型组相比，经GSP各剂量组和MET治疗后，给药组每10 g体质量24 h动态饮食饮水量明显减少，多饮多食症状有所减轻，差异有统计学意义(

P

<0.05，

P

<0.01)。见图2。

2.3 GSP对糖尿病小鼠心功能、HWI和KWI的影响

与对照组相比，模型组小鼠的LVSP、±dp/dt、射血分数(ejection fraction，EF)、心输出量(CO)均明显降低，LVEDP明显升高，见图2。提示小鼠出现明显的心功能不全特征。经GSP各剂量组和MET给药治疗后明显改善了心功能参数。与对照组相比，模型组HWI、KWI有所升高，KWI的差异具有统计学意义(

P

<0.05)；与模型组相比，各给药组HWI、KWI有降低的趋势。见图3。提示GSP具有一定的改善心功能不全作用。

图2 葡萄籽原花青素对实验性糖尿病小鼠实验周期内动态饮食量和饮水量的影响

图3 GSP对糖尿病小鼠HWI、KWI的影响

2.4 GSP对心脏病理形态学改变的影响

Masson染色结果显示(图4)，与模型组相比，各给药组能明显减少糖尿病小鼠的心肌胶原沉积，改善心肌纤维化，差异有统计学意义(

P

<0.01)。

2.5 GSP对血清ET-1、NO、MDA、GSH含量及

SOD活性的影响

与对照组相比，模型组血清中SOD活性、GSH含量明显降低，MDA含量明显增高，而经GSP与MET治疗后血清中SOD活性明显提高、GSH含量明显升高，MDA含量明显降低。见图4。经GSP各剂量组和MET治疗后，血清中ET-1含量明显降低，NO含量明显升高，差异有统计学意义(

P

<0.05，

P

<0.01)。见图5。

图4 GSP对实验性糖尿病小鼠心脏组织病理形态学的影响

图5 GSP对实验性糖尿病小鼠血清MDA、GSH含量及SOD活性的影响

表1 GSP对糖尿病小鼠心功能的影响

2.6 GSP对eNOS、内皮素A受体表达的影响

免疫荧光、ELISA和Western blot结果显示，与对照组相比，eNOS含量明显降低；与模型组相比，GSP各剂量组剂量组、MET组含量明显升高，差异有统计学意义(

P

<0.05，

P

<0.01)。Western blot显示，与对照组相比，模型组ETA含量明显升高；与模型组相比，各给药组ETA的含量明显降低。见图7。

图7 GSP对实验性糖尿病小鼠eNOS和ETA表达的影响

3 讨论

在糖尿病中，慢性高血糖会产生多种并发症，不仅会导致微血管病变，也会构成大血管和心肌的病变，目前，心肌异常与糖尿病之间的因果关系已得到很好的证实。GSP作为自然界广泛存在的多酚类化合物，其对心血管系统的活性已逐渐被人们认识。既往研究显示GSP可通过其强大的抗氧化、改善内皮功能障碍以及降低动脉粥样硬化风险指数、改善脂质特性等药理学效应而发挥心肌保护作用。本研究中，与对照组相比，模型组动态血糖、糖耐量、糖化血清蛋白、饮食饮水量均明显升高，且差异有统计学意义，提示造模成功。研究结果显示，与模型组相比，GSP组心肌细胞横截面积、心肌纵径宽度、心肌胶原沉积含量均明显减小，表明GSP可改善心肌及心肌血管周纤维化，抑制心脏损伤的发生和发展。

图6 GSP对实验性糖尿病小鼠血清ET-1和NO含量的影响

DCM以心肌代谢紊乱、心肌纤维化为基础的病变, 发生心肌结构异常, 最终导致心室肥厚扩大、舒张和收缩功能障碍等。其心功能不全的临床过程是由亚临床异常(如左室纤维化和舒张功能障碍)发展为严重舒张性心力衰竭(射血分数异常)，并最终发展为收缩功能障碍伴射血分数的降低，DCM发生、发展过程中，氧化应激损伤扮演重要角色，表现为活性氧(ROS)蓄积触发细胞膜脂质过氧化、激酶过度磷酸化和DNA突变，引起心肌细胞结构和功能异常，并导致心肌细胞不可逆损伤和凋亡发生。SOD和GSH是体内重要的内源性抗氧化剂，而MDA是脂质过氧化反应的主要终产物。因此，测定心肌中SOD活性、GSH含量以及MDA含量可以反映机体中氧自由基水平及脂质过氧化反应程度。本研究结果表明，与对照组相比，模型组血清MDA含量明显增加、SOD活性明显降低、GSH含量明显下降，差异具有统计学意义(

P

<0.01)。而经各GSP剂量组、MET组给药治疗后，能明显降低血清MDA含量，提高血清SOD活性和GSH含量。提示GSP可能通过抗氧化应激发挥保护作用，这种作用可能与其独特的分子结构及分子结构中大量酚羟基的存在有关。