苹果酸酶2乙酰化调控脑胶质瘤细胞增殖的机制

张 成，牛朝诗，梅加明，司文霞，魏祥品

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的半数以上，恶性程度高，易复发，对放化疗不敏感，治疗困难。近几年来，人们对肿瘤细胞代谢的认识逐渐加深，靶向肿瘤细胞代谢成为一种有前景的治疗策略。

苹果酸酶2(malic enzyme 2，ME2)是苹果酸酶家族的一员，定位于线粒体中。作为调控线粒体氧化还原稳态的代谢酶，ME2在包括脑胶质瘤在内的许多肿瘤中高表达，然而其作用机制并不清楚。研究指出乙酰化修饰在调控肿瘤细胞代谢中发挥关键作用，该研究旨在阐明ME2乙酰化修饰的分子机制及其在恶性脑胶质瘤增殖中的功能，为进一步的体内研究提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

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质粒 pCDNA3.1-HA质粒、pCDNA3.1-Flag质粒、shRNA空载体质粒pLKO.1和慢病毒包装系统质粒pMD2.G、pSPAX由本实验室保存。

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细胞 人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87MG和人肾上皮细胞系293T购自中国科学院上海细胞库。

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主要试剂 胎牛血清(FBS)及DMEM培养基购自美国Hyclone公司；鼠抗人Flag、HA、actin抗体购自武汉ABclonal公司；去乙酰化酶Sirtuin3(deacetylate Sirtuins 3，SIRT3)(#2627)、ME2(#12399)、pan-AcK(#9441)购自美国cell signaling technology公司；

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-苹果酸、Flag 磁株(M2)购自美国sigma公司；转染试剂lipo2000购自美国Thermo Fisher公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(#S0033)、CCK-8试剂盒(#C0038)和RIPA细胞裂解液(#P0013D)购自于上海碧云天公司。SIRT3 siRNA序列：5′-AAGUCUGGAAUGCCACUGGTT-3′，由上海吉玛公司合成。 ME2 shRNA靶序列为5′-GCACGGCTGAAGAAGCATATA-3′，连接于pLKO.1-puro 载体上。

1.2 方法

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细胞培养 U87MG细胞置于37 ℃、5%CO恒温培养箱中培养；90%DMEM培养基加入10%FBS配制成完全培养基。

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免疫沉淀 本研究主要涉及到的蛋白表达质粒包括ME2野生型(WT)和ME2突变体(K156Q和K156R)。293T细胞转染相应质粒48 h后，加入RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)，30 min后，12 000 r/min离心20 min，取上清液加入15 μl Flag beads，于4 ℃孵育过夜。再将beads用裂解液清洗3次(2 000 r/min离心2 min)，最后吸尽上清液，加入40～60 μl 1×上样缓冲液，置于95 ℃煮10 min，离心后，样本可用于检测ME2的乙酰化修饰或蛋白相互作用，或将样本冻存于-80 ℃。

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Western blot 将蛋白样品上样后，80 V电泳30 min，转至120 V电泳至结束。湿转法将蛋白转至PVDF膜上，将膜置于5%脱脂牛奶，室温封闭1 h。加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次。加入二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜3次。最后，通过ECL化学发光显影，并用凝胶成像系统拍照。

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慢病毒包装和感染 在10 cm培养皿中铺293T细胞，待密度80%左右时共转染1 μg pMD2.G、3 μg pSPAX和4 μg目的质粒，进行包装病毒。8 h后换液，36～48 h后收含有病毒的细胞上清液，离心后感染U87MG细胞。感染48 h后，更换含有2 μg/ml 嘌呤霉素抗性的培养基，筛选稳定过表达或者敲低的细胞系。

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ME2酶活检测 293T细胞转染对应的质粒，将WT或K156R突变体分别与pCDNA3.1-Flag空载体或HA-SIRT3质粒共转染。48 h后，将细胞裂解，用Flag磁珠纯化ME2蛋白。将蛋白与180 μl酶活反应液(33 mmol/L KHPO，3.3 mmol/L MgCl，167 μmol/L NAD，167 μmol/L

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-苹果酸)混合。随即用酶标仪读取340 nm下的吸光度值，每30 s测1次，持续30 min。计算每秒生成NADH的摩尔数(μmol NADH/s)即为ME2相对活性。

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ROS水平检测 293T细胞转染对应的质粒，control组转染pCDNA3.1-Flag空载体质粒，ME2组转染Flag-ME2质粒，ME2+SIRT3组转染Flag-ME2和HA-SIRT3质粒。48 h后，将细胞消化收集，重悬于PBS中，加入终浓度20 μmol/L的荧光探针DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀。反应结束后，用PBS清洗3次，计数，将酶标仪设置488 nm激发波长，525 nm发射波长，读取细胞荧光值，计算ROS相对水平。具体操作参考上海碧云天公司细胞ROS检测试剂盒说明书。

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NADH测定 U87MG细胞内NADH含量通过NAD(P)H-Glo Detection System (Promega G9072)试剂盒测定。实验方法同1.2.5细胞裂解后离心分离上清液，将上清液与酶活反应液混合，随即用酶标仪读取340 nm下的吸光度值，以每毫克蛋白对应测得的NADH量(nmoL/mg蛋白)反映胞内的NADH水平。

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U87MG细胞增殖 将处理后的U87MG细胞野生型或者K156Q突变型消化重悬后，按照2 000个/100 μl加入96孔板，同时设置无细胞空白对照组，分别于第1、2、3、4、5天的时间点，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃避光孵育2 h后，用酶标仪读取450 nm的吸光度值(OD)。以时间为横坐标，相对OD值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。具体操作参考CCK-8检测试剂盒说明书。

例4：原文：Liam Hennessy：What on earth makes you think I know who killed your daughter?

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裸鼠成瘤 购买4～6周龄的雌性BALB/c-nu/nu裸鼠，将U87MG细胞野生型或者K156Q突变型消化处理后，制成1.0×10个/ml细胞悬液，每只裸鼠注射剂量为0.1 ml，接种于裸鼠左侧腹部皮下建立裸鼠荷瘤模型。观察并测量记录成瘤情况，直到第22天实验结束时停止。第22天时，断颈处死裸鼠，剥离肿瘤块，拍照、称重。

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临床样本检测 取实验室冻存的临床脑胶质瘤样本，将癌和癌旁组织(病变部位旁2 cm之外的组织区域)分别研磨，裂解提取蛋白，用ME2的抗体进行免疫沉淀，纯化ME2蛋白，再通过Western blot检测ME2的乙酰化修饰。

2 结果

2.1 K156乙酰化对ME2催化活性的影响

通过检索质谱数据库并比较各物种ME2蛋白序列的保守性，猜测K156位可能是ME2的乙酰化位点，见图1A。将K156位点突变成模拟乙酰化的Q和模拟去乙酰化的R，然后用泛乙酰化抗体检测修饰水平的变化，结果如图1B所示：K156R和K156Q突变体的乙酰化水平与野生型相比降低。因为乙酰化修饰往往参与调控代谢酶活性，于是本研究检测了WT与K156R的活性，结果显示K156R突变对酶的活性无显著影响，而K156Q突变体活性降低，差异有统计学意义(

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=17.94，

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<0.001)，见图1C。

图1 ME2乙酰化位点的鉴定及其对酶活的影响

2.2 SIRT3去乙酰化ME2

ME2定位在线粒体中，作为线粒体主要的去乙酰化酶，SIRT3与ME2相互作用(图2A)。同时，外源过表达SIRT3会降低ME2的乙酰化修饰水平(图2B)，而敲低SIRT3则提高ME2乙酰化修饰(图2C)。

图2 SIRT3与ME2的相互作用及对ME2乙酰化的影响

2.3 SIRT3对ME2催化活性及细胞内ROS水平的影响

为了研究SIRT3调控的ME2乙酰化在细胞内的生理功能，将SIRT3与ME2共转染，结果显示，相较于Control组，过表达SIRT3提高了WT的活性(

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=11.33，

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<0.01)，而对K156R活性没有影响(图3A)，表明K156乙酰化负调控ME2活性。此外，因为ME2催化反应生成的NADH是细胞重要的还原力，相较于WT细胞内ROS和NADH水平，过表达ME2降低了细胞内的ROS水平(

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=9.98，

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<0.01)，提高了NADH水平(

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=4.31，

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<0.01)；而同时过表达ME2和SIRT3则进一步降低ROS(

t

=15.15，

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<0.01)，提高胞内NADH含量(

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=10.13，

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<0.01)，差异有统计学意义(图3B、C)。

图3 SIRT3对ME2活性和细胞ROS及NADH水平的影响

2.4 ME2乙酰化修饰对恶性脑胶质瘤细胞增殖的影响

为了研究SIRT3调控的ME2乙酰化对U87MG细胞增殖的影响，在U87MG细胞中，通过包装病毒感染，敲低内源ME2之后，再外源表达WT和模拟乙酰化突变体K156Q(图4A)。回转WT的细胞增殖速率高于K156Q突变体(图4B)；通过裸鼠成瘤实验，皮下接种的K156Q U87MG细胞成瘤大小和质量小于野生型细胞(

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=7.238，

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<0.001)(图4C)。此外，通过对恶性脑胶质瘤的临床样本检测显示癌组织中的ME2乙酰化低于癌旁组织(图4D)。

图4 ME2乙酰化对U87MG细胞增殖的影响

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，约70%的成人脑肿瘤都是胶质瘤。在常规的外科手术以及放化疗干预下，患者的5年生存率仍然很低。近十几年以来，针对致癌信号通路中关键分子如EGFR、VEGF、ERK等的靶向药物在肿瘤的治疗中取得很大进展。然而，在恶性脑胶质瘤尤其是多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者中，这些靶向药物有效时间短，细胞易出现耐药性，治疗效果有限。越来越多的证据表明肿瘤细胞通过代谢重编程以满足对高能量的需求，协调细胞合成代谢和能量生成，维持细胞的快速增殖。深入研究关键代谢酶在肿瘤发生发展中的作用将为开发靶向药物提供新的视角。

ME2催化的反应将三羧酸循环中的苹果酸转化成丙酮酸，同时产生的NADH，是细胞内重要的还原力和能量来源。ME2的高表达如何影响肿瘤进展的机制还不清楚。有报道指出ME2可以激活AKT通路，促进细胞增殖。此外，在K562细胞中敲低ME2会促进细胞凋亡，抑制增殖和成瘤。同样，在U2OS和HCT116细胞水平上，沉默ME2可抑制细胞增殖。总的来说，越来越多的证据支持ME2作为一个致癌因子，促进肿瘤发生发展。值得注意的是，已有报道初步筛选出针对ME2的小分子作为抗癌药物。

乙酰化作为一种重要的翻译后修饰，在细胞核中通过动态调控染色体的紧密度影响多种基因的转录，而在细胞质中大部分的代谢酶都存在乙酰化修饰，调控其酶活及稳定性等。本研究表明SIRT3去乙酰化ME2(图2)，提高其活性，帮助细胞生成NADH，更好地清除ROS(图3)，维持细胞的氧化还原稳态。作为线粒体内最主要的去乙酰化酶，SIRT3在维持线粒体稳态，调控衰老、免疫、神经系统等方面发挥重要作用。而SIRT3在肿瘤中的功能一直不是很清楚，促癌和抑癌的功能皆有报道，该研究也从ME2的角度暗示SIRT3是一个促癌因子。

综上所述，该研究从乙酰化修饰的角度阐述了代谢酶ME2通过影响细胞NADH水平及ROS的清除，从而调控U87MG增殖的分子机制，有助于从代谢的视角深入认识脑胶质瘤的发生发展。该研究也从一定程度上说明通过上调SIRT3，降低ME2活性，能达到抑制脑胶质瘤细胞增殖的目的。此外，在动物模型和临床标本上的研究也进一步验证了ME2的乙酰化修饰抑制增殖的功能。后续的研究可围绕ME2 K156位点的乙酰化修饰制备特异性抗体，对更多的临床样本进行检测，研究该位点的修饰与恶性脑胶质瘤患者发展进程及预后的关系，为恶性脑胶质瘤患者的诊断和治疗提供更多的思路。