基于转录组测序的ATPR诱导NB4细胞分化过程中lncRNA的初步鉴定与分析

冯钰斌，胡 爽，李兰兰，徐小玲，张梅菊，彭晓清，陈飞虎

急性早幼粒细胞白血病 ( acute promyelocytic leukemia,APL) 属于急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML) 的M3分型，临床上主要采用诱导分化治疗，全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)是临床治疗的首选药物，但维甲酸综合征、耐药性等都是其副作用。为了避免这些副作用，课题组前期对ATRA进行结构改造，得到了很多ATRA衍生物，经过前期的药效学筛选，发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)具有较强的抗肿瘤活性。

长链非编码RNA (long-chain non-coding RNA，lncRNA)主要是通过顺式或反式作用调节来发挥基因表达的作用。lncRNA不仅可以调节上皮间质转化过程，还可以充当 microRNA 海绵来调节信号通路。lncRNA 比 mRNA 的特异性更高，所以lncRNA更有可能被开发成肿瘤诊断和预后的标志物。该研究以NB4细胞为研究对象，运用基因芯片技术筛选出ATPR与ATRA分别作用于NB4细胞后差异表达的lncRNA和mRNA，以此探讨ATPR 对 NB4 细胞作用的可能机制及分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

委托合肥新星药业有限公司合成纯度达到99.66%的ATPR(图1)，用无水乙醇将其溶解成浓度为20 mmol/L 的母液，-20 ℃ 避光保存备用；阳性药ATRA购自美国Sigma公司；NB4细胞株购自中科院上海细胞库；RPMI 1640购自Hyclone 公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

图1 ATPR分子式

1.2 细胞培养与加药处理

为了得到对数生长期的细胞，在温度为37 ℃、CO浓度为5%的培养箱中培养细胞，待满足生长条件后，随机将细胞分为两组，用终浓度为1×10mol/L的ATRA和ATPR 分别处理细胞，培养72 h后收集细胞。

1.3 lncRNA和mRNA基因芯片表达谱

委托上海欧易生物科技有限公司代为完成基因芯片表达谱的构建与分析。具体方法参考文献。

1.4 统计学处理

采用 Feature Extraction 软件处理原始图像，提取原始数据。采用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为 “

P

” 的探针留下进行后续分析。利用

t

检验的

P

值和倍数变化值(Fold change,FC)进行差异mRNA和差异lncRNA筛选，筛选的标准为上调或者下调FC≥2.0且

P

≤0.05。对差异lncRNA进行GO和KEGG富集分析，以判定差异lncRNA主要影响的生物学功能或者信号通路。最后，对差异mRNA和差异lncRNA进行非监督层次聚类，利用热图和火山图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。

2 结果

2.1 两组lncRNA和mRNA的表达分析

与ATRA 组比较，利用基因芯片在ATPR组筛选出很多差异表达的lncRNA(FC>2，

P

<0.05)，在这些差异表达的lncRNA中，有511个是上调的，其余264个是下调的。紧接着对差异表达的标准化数据进行分析，制成火山图 (图2A) 和热图 (图2C)。筛选出的排名前10的上调和前10的下调的lncRNA已经列出，见表1。结果显示，在所有上调的lncRNA转录物中， lnc-COPS4的上调倍数最大，FC 达到了32.88，而lnc-ZNF569的下调倍数最大，FC达到了-9.65。依据相同的筛选标准 (FC>2，

P

<0.05)，有904个异常表达的mRNA转录本被发现，其中上调的有724 个，下调的有180 个 (图 2B、D)。上调倍数最多和下调倍数最多的mRNA转录物分别是SDC2和 ARG1，FC达到了24.89和-13.26。

图2 两组差异表达的lncRNA和mRNA的火山图和热图分析

表1 基因芯片结果中上调和下调前10位lncRNA

2.2 差异表达的lncRNA 的功能分析

为了研究差异表达lncRNA的功能，我们采用GO分析和KEGG通路注释对前200个差异表达lncRNA的功能进行预测分析。GO分子功能分析结果显示，排名前列的涉及一些发病机制的功能途径，如 poly (A) RNA binding、receptor activity、protein binding、MAP kinase tyrosine phosphatase activity、heparin binding等(图 3A)。GO分析的生物过程结果显示这些差异表达的lncRNA富集结果如下：positive regulation of inflammatory response、blood coagulation、immune response和blood vessel morphogenesis等(图 3B)。KEGG 信号通路富集分析结果表明这些差异lncRNA可能涉及到很多信号通路，排名第1的是Protein processing in endoplasmic reticulum，大概会有16个lncRNA参与其中。富集结果同样表明lncRNA富集的“化学致癌”和“剪接体”可能参与了白血病的发生发展，其中最为经典的“Notch信号通路”，同样可能参与了白血病的发生 (图 3C)。

图3 GO和KEGG分析差异表达前200位lncRNA高度富集的通路

2.3 ATPR组中lncRNA的顺式调节与反式调节

lncRNA主要通过调节染色体的结构来发挥功能，最为经典的是除了顺式调控的方式调节自身转录，还可以通过调节自身近端的基因表达来发挥作用。为了探究筛选的差异表达lncRNA的功能，以期找到潜在的lncRNA的顺式调控基因，课题组筛选了这些差异表达lncRNA上游和下游100 kb范围内的染色体相关基因。根据以上介绍的标准，发现很多新的lncRNA可以顺式调控基因的表达。lncRNA参与一些生物途径可能与转录因子有关。Pearson相关分析预测与前200个差异表达的lncRNA所相关的转录因子。进一步计算转录因子与lncRNA的相关性，发现TAF7、E2F4、KAT2A、TBP、BCLAF1和GTF2F1是最丰富的转录因子。为了进一步探索lncRNA的转录调节功能，通过 Cytoscape 软件对前 100 对 lncRNA-转录因子调控制作更为直观的可视化核心网络图，按照

P

值从小到大排序，二元关系网络图使用前100行的调控关系作图(图4A)，三元关系网络图取前10行的调控关系作图(图4B)。该图显示这些转录因子可以调节很多lncRNA的表达。

图4 差异表达lncRNA顺式和反式调节预测分析

3 讨论

ATRA对肿瘤细胞的增殖具有很好的抑制作用，并且还可以诱导其分化。但是ATRA具有很多副作用，如耐药、维甲酸综合征等，这大大限制了它的使用。为了避免这些副作用，本课题组前期对ATRA进行结构改造，合成了一系列的维甲酸衍生物，经过前期的药效学筛选，发现ATPR可以在一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖并且诱导其分化，如 K562 细胞、NB4细胞。lncRNA 由于不具有编码任何蛋白质的能力，一直被认为是基因转录的副产物或者噪音，但有研究表明lncRNA与肿瘤的发生发展密切相关。因此lncRNA的研究逐渐成为白血病基因组学的新领域，lncRNA 是否可以成为ATPR治疗白血病的新靶点有待深入研究。这对于白血病的治疗具有重要意义。

本研究通过分析基因芯片测序ATRA和ATPR作用于 NB4 细胞后的基因表达谱，经筛选得到一批差异表达的 lncRNA，其可能成为白血病治疗的新靶点。经进一步的研究表明，与ATRA比较，ATPR 可能是通过 poly (A) RNA binding、receptor activity、protein binding、MAP kinase tyrosine phosphatase activity、heparin binding 等生物学过程发挥作用。 KEGG 信号通路富集分析结果显示，Notch 信号通路与ATPR在白血病治疗中的表观遗传机制密切相关，提示ATPR很有可能通过 Notch 信号通路治疗白血病。同时，为了进一步探究这些lncRNA在白血病中的调控方式，利用 Cytoscape 软件构建相关lncRNA的可视化网络图来分析其反式调控情况，结果显示， E2F4、TAF7、KAT2A、TBP、BCLAF1、GTF2F1 等转录因子对相关lncRNA具有一定的调控作用，这些转录因子在ATPR对白血病的治疗过程中发挥重要作用。

E2F4 作为转录抑制因子，是属于 E2F 转录因子家族的一员，它在细胞周期阻滞过程中发挥非常重要作用。Feng et al研究也表明 E2F4 与白血病的发生发展密切相关。Khaleel et al发现 E2F4 高表达会加重乳腺癌患者的病情，缩短存活期。研究结果还显示转录因子 TAF7 在调节转录起始过程中也发挥重要作用。但是其仍需在癌症领域进行更深层次探究。基于此，本课题组后续将研究在ATPR治疗白血病过程中，相关转录因子和lncRNA之间的调控机制。

综上所述，ATPR 可以通过改变lncRNA的表达水平来调节细胞生长增殖、诱导细胞分化和凋亡等过程。这些 lncRNA 可能与ATPR抑制 NB4 细胞增殖并诱导其分化及其耐药机制有关。