裸鼠异种移植急性T淋巴细胞白血病模型的建立

张爱君，潘文文，胡晓曦，吴育晶，魏 伟

急性T淋巴细胞白血病(acute T-cell lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一种来源于骨髓的侵袭性恶性肿瘤。近年来，我国T-ALL发病率呈升高趋势，部分患者出现耐药和复发等现象导致预后不佳，因此T-ALL的相关病理机制和药理学研究有着重要意义。目前对T-ALL疾病发病机制的认识很大程度上来源于对人体以及原代人T-ALL细胞的体外研究，在研发治疗T-ALL新药的药理学研究中，实验动物模型的选择和建立至关重要。目前的白血病动物模型包括异种移植性白血病、自发性白血病、诱发性白血病和转基因动物模型，其中异种移植性白血病模型较为常用，多选用BALB/c 裸鼠造模。T-ALL动物模型的建立除了动物种类，移植途径的选择也很重要。因此，为了建立操作简便、经济可靠、重复性好和观察指标明确的T-ALL模型，该文将通过比较尾静脉移植和皮下移植人Jurkat细胞建立异种移植T-ALL裸鼠动物模型的优缺点，为研究T-ALL的发病机制以及相关新药的研发奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要药物、试剂与仪器

环磷酰胺粉针剂(CTX，0.2 g/支)购自安徽医科大学第一附属医院；BV421抗人CD3抗体购自美国BioLegend公司；CD3抗体购自美国Santa Cruz公司；Triton X-100购自上海碧云天公司；EDTA抗原修复液、HO、DAB购自北京中杉金桥生物技术有限公司；仪器Olympus显微成像系统购自日本Olympus公司；CytoFLEX型流式细胞仪购自美国贝克曼公司；人白介素-2(interleukin-2, IL-2)ELISA试剂盒购自南京优宜佳生物科技有限公司；Tecan Infinite M1000酶标仪购自瑞士TECAN公司。

1.2 细胞来源与培养

人Jurkat细胞株购于美国ATCC细胞库，将Jurkat细胞置于10%灭活胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640培养液中，然后放入37 ℃、5% CO恒温培养箱中培养。

1.3 实验动物

40只雌性BALB/c裸鼠，5周龄，体质量17～20 g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司[SPF级，合格证号：SCXK(苏)2018-0008]。

1.4 T-ALL白血病细胞移植

将40只裸鼠随机分为正常组(

n

=10)、尾静脉移植组 (

n

=15)和皮下移植组(

n

=15)。粉针剂环磷酰胺用灭菌0.9 %氯化钠溶液稀释成浓度为20 mg/ml的溶液，腹腔注射CTX 2 mg/只，连续注射2 d；第3天收集处于对数生长的Jurkat细胞，调整细胞密度至2.5×10个/ml。尾静脉移植组裸鼠，尾静脉缓慢注射无菌Jurkat细胞5×10个/只(0.2 ml)，连续注射2 d；皮下移植组裸鼠，于裸鼠颈背皮下注射无菌Jurkat细胞5×10个/只(0.2 ml)，连续注射2 d。

1.5 动物饲养

所有裸鼠饲养在层流架上无菌独立送风隔离IVC笼中, 与其接触的物品、饲料和饮用水均须灭菌处理。SPF条件下饲养1周后正常组裸鼠尾静脉注射0.2 ml无菌PBS，其余两组分别采取尾静脉移植和皮下移植进行细胞移植。

1.6 观察记录

每天观察裸鼠进食、行动、弓背及精神情况；每周记录1次体质量。裸鼠出现明显消瘦、弓背、精神萎靡、体质量下降20%时视作濒死状态。

1.7 标本采集及处理

分别在造模第7天和第14天时裸鼠尾部取血20 μl，进行流式细胞术检测并挑选出造模成功裸鼠。造模第28天裸鼠出现明显消瘦、弓背、体质量下降超过20%，眼球取血后颈椎脱臼法处死并取出裸鼠肝、脾组织，取部分脾脏轻轻研磨，制成单细胞悬液用于流式细胞术检测，剩余组织置于4%的多聚甲醛中常温保存。

1.8 流式细胞术检测裸鼠外周血、脾脏和骨髓中Jurkat细胞

分别将第7天和第14天时取的20 μl外周血，用红细胞裂解液完全裂解后离心得细胞沉淀，然后向细胞沉淀中加入50 μl PBS重悬混匀，加入检测所需抗人CD3流式抗体，混匀后4 ℃避光孵育30 min。清洗1次后流式细胞仪上机检测Jurkat细胞在裸鼠外周血中的百分比。以裸鼠外周血中有Jurkat细胞表达为造模成功。根据Jurkat阳性裸鼠数量计算造模成功率，挑出造模成功裸鼠进行后续实验。

第28天颈椎脱臼处死裸鼠后，取出脾脏充分研磨，获取的脾脏细胞用50 μl PBS重悬混匀，同法加入抗体孵育后用流式细胞仪检测。取得的骨髓细胞用50 μl PBS重悬混匀，同法加入抗体孵育后流式细胞仪检测。通过检测各组裸鼠脾脏和骨髓细胞中人CD3细胞百分比，反映裸鼠脾脏和骨髓细胞中Jurkat细胞浸润情况。

1.9 外周血和骨髓瑞氏-吉姆萨染色

取第28天裸鼠新鲜的抗凝全血1滴(约5 μl)，置于干净载玻片的一端1 cm处，左手持载玻片，右手持推片从血滴前方后移接触血滴，使血滴沿推片后缘展开，推片与载玻片以30°～45°、匀速、平稳地向前移动推制成血涂片，滴加瑞氏-吉姆萨染液，染色1 min，再将磷酸盐缓冲液滴加于瑞氏-吉姆萨染液上，以洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染色3～10 min，流水冲洗，待干，镜检。剪掉裸鼠大腿上的皮肤和肌肉，暴露股骨及两端相连的关节，然后从股骨两端关节头处取下股骨，剪断股骨一端，用抽有0.9%氯化钠溶液的1 ml注射器插入骨髓腔深处，将冲出的骨髓液用200目纱网过滤，PBS溶液冲洗1遍后，取10 μl左右进行瑞氏-吉姆萨染色，在光学显微镜下计数200个有核细胞，计算其中Jurkat细胞所占比例(%)。

1.10 裸鼠肝脾病理学和免疫组化学分析

取4 %的多聚甲醛固定48 h后的组织样本，石蜡包埋、切4 μm组织切片。取正常裸鼠对应组织用于组织病理学等对照。采用苏木精-伊红染色法对所取组织进行染色，光学显微镜观察组织病理学变并拍照，检测Jurkat肿瘤细胞株在肝脏和脾脏组织中的浸润情况及病理改变。

1.11 裸鼠肝脾组织免疫组织化学染色

各组裸鼠肝脾组织的石蜡切片经60 ℃恒温箱烘烤2 h，经脱蜡和水化后用抗原修复液热修复15 min，冷却后用山羊血清封闭20 min，加入抗人CD3一抗(1 ∶50)，4 ℃孵育过夜。第2天取出复温，洗涤后加入二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗涤3次滴加DAB显色，选取适当时候终止反应。苏木精染色10～30 s后用蒸馏水冲洗后再经脱水、晾干后，中性树脂封片。最后光学显微镜下观察Jurkat细胞浸润情况。细胞染色呈棕黄色为阳性。

1.12 ELISA检测血清IL-2表达水平

按照人IL-2细胞因子ELISA检测试剂盒说明书操作，检测裸鼠血清中IL-2浓度，反映浸润Jurkat细胞分泌炎性细胞因子功能。将标准品倍比稀释，检测时分别设待测样品孔和空白孔(空白孔不加样品及酶标试剂，其余步骤相同)，每孔加入100 μl标准品或样品，37 ℃孵育90 min，洗板4次，尽量甩干洗液。每孔再加入100 μl生物素化抗体工作液，封口37 ℃孵育60 min，再次洗板后加入100 μl酶结合物工作液，封口，37 ℃孵育30 min，洗板，加入100 μl显色剂，37 ℃孵育10～20 min加入100 μl终止液用酶标仪立即读取450 nm吸光度值，最后根据标准曲线计算裸鼠血清中IL-2浓度。

1.13 统计学处理

SPSS 24.0和GraphPad Prism8软件对结果进行统计学分析。数据用%表示，两组间比较采用

t

检验，多组间差异的比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 整体观察结果

尾静脉移植组和皮下移植组至第7天未出现明显变化，于第14天开始表现出嗜睡、饮食欠佳等状态，于第21天尾静脉移植组和皮下移植组出现弓背、消瘦、活力减低和明显萎靡不振等现象(图1)，于第28天则有部分裸鼠出现濒死状态，伴有脊柱弯曲。正常对照组裸鼠正常生长，活泼好动，食欲精神良好，未出现病态体征。

图1 第21天T-ALL裸鼠整体状态1：正常组；2：尾静脉移植组；3：皮下移植组

2.2 指标检测

2

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2

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1

外周血、骨髓和脾脏流式检测结果 正常组BALB/c裸鼠无胸腺，为先天性T细胞免疫缺陷，人Jurkat细胞表面特异性标志物为CD3，通过流式细胞术检测人CD3细胞的百分比可以反映移植入BALB/c裸鼠体内的Jurkat细胞的百分比。第7天和第14天外周血流式细胞术检测结果显示Jurkat细胞在造模第7天时已经在外周血中浸润，其中尾静脉移植组裸鼠外周血中Jurkat细胞百分比平均为7.24%，皮下移植组平均为4.30%。第14天外周血中Jurkat细胞百分比，尾静脉移植组(16.16%±3.30)高于皮下移植组(8.14%±1.05)(

t

=5.241,

P

<0.01，图2)。第28天裸鼠脾脏细胞流式细胞术检测结果显示：尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠脾脏中均有Jurkat细胞表达，且尾静脉移植组(7.31% ± 2.30%)Jurkat细胞百分比高于皮下移植组(3.60%±1.95%)(

t

=3.838,

P

<0.01)；骨髓细胞检查结果与脾脏一致，尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠骨髓中均有Jurkat细胞表达，尾静脉移植组(3.95% ± 2.95%)Jurkat细胞百分比高于皮下移植组(1.90%±1.35%)，差异有统计学意义(

t

=2.846,

P

<0.05)(图3)。尾静脉移植组成模率为73%，皮下移植组成模率为40%。

图2 流式细胞术检测第7天和第14天Jurkat细胞在裸鼠外周血中百分比

图3 流式细胞术检测脾脏和骨髓中Jurkat细胞百分比

2

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2

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2

体质量检测结果 细胞移植后每周记录各组裸鼠体质量变化，并绘制体质量变化曲线(图4)。与正常组相比，尾静脉移植组和皮下移植组体质量在第7天开始出现缓慢下降，并在第21天出现统计学差异(

F

=20.211，

P

<0.05)。尾静脉移植组和皮下移植组之间差异无统计学意义。

图4 裸鼠体质量变化曲线

2

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2

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3

外周血瑞氏

-

吉姆萨染色情况 建模第28天，裸鼠处死后取外周血涂片进行瑞氏-吉姆萨染色，尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠外周血中均可见Jurkat细胞，尾静脉移植组比例平均为9.11%，皮下移植组比例最高可达6.37%；尾静脉移植组和皮下移植组镜下Jurkat细胞胞体偏大，呈圆形，胞浆量丰富，染蓝色，胞核较大。正常组外周血中未见Jurkat细胞，以红细胞为主，有核细胞少见。见图5。

2

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2

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4

骨髓瑞氏

-

吉姆萨染色结果 尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠处死后骨髓瑞氏-吉姆萨染色均可见Jurkat细胞，尾静脉移植组比例平均可达12%，皮下移植组比例平均为8%，胞体偏大，呈圆形，胞浆丰富。胞核圆形，只有一个明显的核仁。见图6。

图5 T-ALL裸鼠外周血Jurkat细胞浸润 瑞氏-吉姆萨染色×400A：正常组；B：尾静脉移植组；C：皮下移植组

图6 T-ALL裸鼠骨髓Jurkat细胞浸润 瑞氏-吉姆萨染色×400A：正常组；B：尾静脉移植组；C：皮下移植组

2

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2

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5

病理组织学检查 裸鼠脾组织病理切片常规HE染色结果显示：正常组裸鼠脾组织结构完整，红髓和白髓界限明显；而尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠脾组织红髓和白髓增生，界限模糊，并且出现Jurkat细胞浸润现象，呈弥漫性生长。肝脏组织HE染色结果显示：正常组裸鼠肝组织结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状排列，无组织病理学变化；移植了Jurkat细胞的裸鼠肝组织切片可见Jurkat肿瘤细胞浸润，尾静脉移植组裸鼠中Jurkat细胞浸润，且病变程度比皮下移植组裸鼠严重；尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠肝脏均出现部分肝组织坏死，正常肝组织结构被破坏。见图7。

图7 T-ALL裸鼠脾脏和肝脏病理检查结果 HE染色

2

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2

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6

免疫组织化学法检测CD3的表达 CD3分子在Jurkat细胞表面广泛表达，采用免疫组织化学法检测肝脾组织中Jurkat肿瘤细胞侵袭情况。正常组裸鼠肝脾组织经免疫组织化学染色均无棕黄色阳性反应，尾静脉移植组和皮下移植组的肝脾组织则均有阳性反应，并且尾静脉移植组的阳性面积比皮下移植组要高。尾静脉移植组局部可见阳性细胞聚集。见图8。

图8 裸鼠肝脾组织中CD3蛋白的表达 免疫组化法染色 ×100

2

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2

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7

ELISA检测血浆IL-2表达 正常对照组裸鼠血清中无IL-2表达，尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠外周血血清中有Jurkat细胞分泌的IL-2表达，其中尾静脉移植组裸鼠血清IL-2水平高于皮下移植组，差异有统计学意义(

t

=4.085，

P

<0.001)(图9)。

图9 各组裸鼠血清中IL-2水平

3 讨论

选择和建立合理的动物模型是探究T-ALL的病理机制及开发创新药物成功与否的关键。已有的动物实验模型包括异种移植性白血病、自发性白血病、诱发性白血病和转基因动物模型，可一定程度反映T-ALL的病理过程。其中异种移植性动物模型接种人T-ALL细胞更贴近临床T-ALL疾病，是目前较为常用的一种白血病动物模型。

异种移植性动物模型的建立需要考虑多种因素，包括免疫缺陷小鼠、免疫抑制剂和移植途径。免疫缺陷小鼠天生T、B淋巴细胞或NK细胞缺乏，对植入的肿瘤细胞排异反应较小，故成为研究血液学疾病的有力工具。免疫缺陷小鼠包括裸鼠、SCID、NOD/SCID和NSG，其中利用无胸腺免疫缺陷裸鼠是构建T-ALL动物模型中较为常用、经济和易获得的模型动物。裸鼠天生T细胞缺陷、为直接观察和肿瘤的可视化提供了极好的机会，但成年裸鼠(6～8周龄)具有较高的自然杀伤细胞活性，使得体内建立全身白血病模型存在一定难度，需要通过脾脏切除术、全身辐照或使用免疫抑制剂等方法来进一步抑制其免疫功能。脾脏切除术对裸鼠会造成较大的生理性伤害，不符合动物福利要求。全身辐照虽然有较高的造模成功率，但对实验室条件要求较高。免疫抑制剂就相对简单安全，且可操作性更强。免疫抑制剂常用的有环磷酰胺和白消安。移植途径的选择至关重要，常用的细胞移植方式有皮下移植和尾静脉移植，皮下移植即可用于实体瘤造模，也可用于白血病模型；尾静脉移植常用于白血病模型，因此，本文旨在通过比较两种移植方式的优缺点，建立操作简便、经济可靠、重复性好和观察指标明确的T-ALL模型建立方法。

本实验中尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠均出现白血病表现，体质量呈现“增长-缓慢下降-明显下降”的变化趋势，第14天体质量出现减轻，并持续下降，伴随出现弓背、皮肤皱褶和精神萎靡等现象。本文利用流式细胞术动态监测裸鼠外周血中Jurkat细胞浸润变化情况：第7天，裸鼠外周血中已有Jurkat细胞浸润，且随病程逐渐升高；第14天，尾静脉移植组比皮下移植组Jurkat细胞浸润更显著；第28天，尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠外周血、骨髓、脾脏和肝均有不同程度的Jurkat细胞浸润，肝脾组织已发生病理改变。通过裸鼠活体尾静脉取血并动态监测Jurkat细胞浸润变化是鉴定模型成功及确定给药时间的重要手段。传统的瑞氏-吉姆萨染色工作量大、主观性强、对样本要求高，本文采用流式细胞术检测Jurkat表面标志CD3，操作方便、检测准确，可作为瑞氏-吉姆萨染色的辅助观察指标。

本文比较了两种移植方式。皮下移植虽然操作简便，但是在T-ALL造模过程中不易观察到瘤体，成模率和细胞浸润率也较低；尾静脉注射移植方式具有成模率高、肿瘤细胞浸润快、浸润细胞多、更贴近临床T-ALL的转移特征等优点。因此，后者可作为异种移植T-ALL模型较理想的移植方式。

该文中建立的裸鼠尾静脉异种移植T-ALL模型相对于皮下移植方式是一种操作简便、经济可靠、重复性好和观察指标明确的T-ALL模型建立的方法，可为研究T-ALL的发病机制及其相关新药的研发提供实验基础，也为T淋巴细胞白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的基础研究奠定动物实验基础。