高原低氧环境下心脏功能改变及其与自噬蛋白活化的关系

孙海霞，李 方，苏玉鑫，曹 宁

高原低氧环境(high altitude hypoxia，HAH)对长期生活在该地区的人类的健康构成了潜在威胁。由于空气中氧分压较低，易诱发多种心血管疾病，如高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病。尽管这些心血管疾病的病因可能涉及内质网应激、氧化应激和全身炎症，但确切的机制尚不清楚。自噬是一个重要的自我更新过程，其中细胞内容物被降解和再循环，以维持细胞内稳态。最近的研究表明自噬比细胞死亡机制更能促进细胞生存。自噬在心脏中是高度动态的，其基础水平在维持心肌细胞动态平衡中发挥重要作用。自噬的实质性上调可以保护心肌免受多种病理因素的影响，如缺血再灌注和超负荷。相反，自噬功能受损会干扰能量和蛋白质代谢，并导致心肌病，如心力衰竭或心肌纤维化。然而，尚不清楚自噬在HAH下心脏病理中的动态变化和功能作用。研究表明，单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine-5′-monophosphate activated protein kinase，AMPK)是心脏自噬的关键介质，而降低AMPK介导的自噬会诱发心肌纤维化。该研究评估大鼠长期暴露于HAH对心脏功能的影响，并探讨其作用机制是否与AMPK途径介导的心肌纤维化进程中自噬活性有关。

1 材料与方法

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1 实验动物及分组

80只雄性Sprague Dawley大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均为8周龄，体质量200～220 g。将大鼠饲养在标准动物房中，12 h/12 h明暗循环，并自由获得食物和水。环境温度在18～22 ℃，湿度为55%。实验分为2个阶段，第一阶段考察HAH对大鼠心脏功能和心脏自噬蛋白表达的影响。大鼠被安置在4 500 m海拔高度(青海省洛州玛多县)，分别在饲养第0、1、2、4、8周随机选取10只大鼠进行体质量、血压和超声心动图检查，然后处死大鼠，完整摘取心脏，并将其保存在-80 ℃下用于自噬蛋白检查。第二阶段考察自噬诱导剂雷帕霉素对HAH环境下大鼠的心脏保护作用。30只大鼠随机分为2组，每组15只动物，包括对照组和雷帕霉素组。雷帕霉素组每天定时通过腹腔注射雷帕霉素(美国Sigma-Aldrich公司)1 mg/kg，连续治疗8周。对照组腹腔注射相同体积的0.9%氯化钠溶液。分别在试验前和第8周试验结束时进行体质量、血压和超声心动图检查，然后处死大鼠，完整摘取心脏，进行组织学和自噬蛋白检查。

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2 血压记录

使用尾袖法测量清醒状态下大鼠的血压(收缩压)。在用尾袖法记录血压之前，将动物限制在试管中10～20 min/d，持续5 d，以更好地检测尾动脉脉搏，使尾巴穿过袖带和连接至放大器的NIBP尾袖带传感器(澳大利亚AD Instruments公司)，记录充气和放气期间的脉冲。

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3 超声心动图检查

在用乙醚麻醉动物后，使用Vevo 2100超声仪(加拿大VisualSonics公司)进行超声心动图检查，记录右室舒张末内径(right ventricular end diastolic dimension，RVEDd)、左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd)、肺动脉加速时间(pulmonary artery acceleration time，PAAT)、舒张室间隔厚度(interventricular septum thickness at end-diastole，IVSd)、左室舒张后壁厚度(left ventricular posterior walldepth，LVPWd)及左室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色

对心脏组织进行常规固定和处理，获得4 μm石蜡包埋切片，用HE和Masson三色染色进行评估。心肌的组织病理学损伤评分参照Kanda et al报道方法，评分标准如下：0分，正常；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，非常严重。

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5 免疫组化

对各组大鼠的心脏进行免疫组化分析。组织切片经脱蜡、再水化为pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液预处理以获得抗原。将切片在4 ℃的加湿培养箱中孵育2 h，加入兔多克隆抗I型胶原(Col I)(1 ∶50，英国Abcam公司)和单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(1 ∶25，英国Abcam公司)4 ℃下培养、过夜。然后在室温下用二级抗体(美国Santa Cruz公司)染色1 h。使用CX31显微镜(日本Olympus公司)进行检查。

1.6 TUNEL分析

将心肌组织切成2 mm厚的切片，常规石蜡包埋，切片成5 μm厚的切片。用TUNEL试剂盒(瑞士Roche Applied Science公司)检测细胞凋亡。

1.7 Western blot分析

将心脏组织在冰冷的RIPA裂解液中超声裂解。将细胞裂解物在4 ℃下以10 000 r/min离心30 min。然后通过BCA法(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定蛋白质浓度。在10%SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质(50 μg)，并转移到PVDF膜上。使用抗微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬基因(Beclin-1)、p-AMPK(美国Bioworld Technology公司)和β-actin(武汉Boster公司)孵育过夜。在室温下用适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗(1 ∶3 000，美国Santa Cruz Biotechnology公司)孵育2 h。最后，使用增强化学发光试剂盒(美国Thermo Scientific公司)观察印迹。

2 结果

2.1 HAH环境暴露对大鼠体质量、血压和心脏功能的影响

大鼠的收缩压、体质量、RVEDd、LVEF随着HAH环境暴露时间的增加而增加(

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<0.05)，PAAT则降低(

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<0.05)。见表1。

表1 HAH暴露对大鼠体质量、血压和心脏功能的影响

2.2 HAH环境暴露对大鼠心脏组织病理学影响

不同HAH环境暴露时间，心脏的组织病理学改变及其损伤评分见图1。HE染色显示，随着HAH环境暴露时间的不断延长，大鼠出现心肌变性、坏死和纤维化，伴有单核细胞浸润(图1B)，并且在Masson三色染色中，大鼠心脏心肌纤维化面积逐渐增加(图1C)。

图1 HAH环境暴露对大鼠心脏组织病理学影响

2.3 HAH环境暴露对大鼠心脏自噬蛋白影响

心脏组织中检测到Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和AMPK的蛋白表达呈抛物线波动。心脏组织自噬相关蛋白在第4周增加，并达到峰值水平，但在第8周后受损(图2)。

2.4 雷帕霉素对HAH环境暴露下大鼠的心脏保护作用

通过测定雷帕霉素存在和不存在时心肌纤维化的多项指标，评价了自噬在HAH诱导的心肌纤维化中的作用。与对照组相比，雷帕霉素组SBP、RVEDd、LVEF降低(

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<0.05)，PAAT则升高(

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<0.05)(表2)。与对照组相比，雷帕霉素组自噬相关标记物Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和AMPK蛋白表达升高(

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<0.01)(图3A)。HE和Masson三色染色显示，雷帕霉素组大鼠出现心肌变性、坏死、纤维化和伴有单核细胞浸润减少(图3B)。雷帕霉素组中凋亡细胞核的百分比降低(

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<0.01)(图3C)。IHC图像显示雷帕霉素组中Col I、α-SMA的阳性染色较对照组减少(

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<0.01)(图3D)。

图2 HAH环境暴露对大鼠心脏自噬影响

表2 雷帕霉素对HAH环境暴露下大鼠体质量、血压和心脏功能的影响

图3 雷帕霉素对HAH环境暴露下大鼠的心脏保护作用

3 讨论

最近的研究表明，HAH暴露引起的血管张力增加可能导致肺血管重塑、心室重构和右心衰竭。其中，心室重构的特点是细胞外基质改变，包括Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，被认为是参与心肌纤维化的主要因素。因此，HAH暴露可诱发心血管疾病。本研究显示，暴露在HAH环境下大鼠的高血压和心肌功能障碍的发展有时间依赖性特点。以前的研究表明HAH诱导的高血压至少需要3周，本研究显示，在HAH暴露早期(2周)大鼠SBP升高程度较高，并在第4周后维持在一个相对稳定的水平，但仍高于0周水平。SBP升高可能反映了适应机制，包括压力感受器适应、副交感神经上调和一氧化氮合成增加。超声心动图评估显示，RVEDd随着时间的变化而增加。增加的RVEDd / LVEDd比值与肺动脉高压的严重程度相关。此外，暴露于HAH后，大鼠LVEF增加，这与之前的研究中描述的结果一致。上述结果提示，长期HAH暴露可导致心脏功能严重改变。

近年来，自噬已被证明是参与生理和病理性心肌纤维化的一个关键因素。心脏自噬是一个高度保守和动态的生理过程。以前的研究在急性心肌梗死模型中观察到心肌自噬在急性期诱导亚急性期和慢性期受损；而通过使用雷帕霉素增强自噬作用，可拮抗急性心肌梗死诱导的心肌纤维化。另一项关于急性心肌梗死期间心脏自噬的研究提示，急性心肌梗后早期远端心肌的LC3持续增加，而梗死后较长时间后LC3下降。本研究探讨了长期HAH后心脏自噬的动力学变化及功能作用。自噬相关蛋白的生化检测结果表明，在HAH暴露期间，自噬在最初的代偿性增加后减少并维持在一个较低的水平，与Wu et al研究中描述的趋势相似。

基础条件下的自噬水平是维持心肌结构和功能的重要稳态机制。研究表明，自噬的上调可以保护心肌免受各种病理刺激，如缺血再灌注、过载。然而，受损的自噬不足以处理这些病理因素，导致胞质蛋白更新减少和蛋白质聚集体积聚从而诱发心肌病。在本研究中，通过测量心肌纤维化的几个指标，检测到HAH下心肌纤维化的改变和自噬受损的功能障碍。为了探讨在长时间HAH暴露过程中自噬受损的意义，用雷帕霉素治疗大鼠来上调这一过程。结果表明，雷帕霉素能恢复心肌自噬功能，逆转HAH诱导的心肌纤维化和功能障碍。因此，HAH损伤了心肌自噬功能，而自噬是HAH诱导心肌纤维化的必要条件。

AMPK作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在心脏中高度表达，并对心脏自噬至关重要。研究表明上调AMPK能诱导自噬的发生，并保护心肌细胞免受各种病理因素的影响，如缺血和梗死。此外，AMPK缺乏会干扰自噬体的形成，从而降低心脏功能并导致心肌纤维化。AMPK失活限制了氧化应激下心肌细胞的保护性自噬机制。本研究显示在HAH暴露过程中AMPK表现出与自噬相关蛋白相似的时间变化过程，并且雷帕霉素治疗上调了AMPK表达。这些结果表明HAH下心肌细胞自噬与AMPK的调控有关，然而具体的调控机制有待于进一步研究。

综上所述，长期暴露于HAH环境破坏大鼠心脏功能，其作用机制与AMPK途径介导的心肌纤维化进程中自噬活性有关。