柚皮素预处理通过抑制NLRP3炎症小体通路减轻小鼠机械通气相关性肺损伤

王 萍，唐宋琪，农开旭，邢春蕊

机械通气作为一种治疗急性呼吸衰竭患者生命维持的重要干预手段，已广泛应用于临床，但机械通气所造成的应力损伤可破坏肺组织内细胞膜结构，导致肺部炎症因子大量释放，引发肺损伤。然而，机械通气相关性肺损伤(ventilation-induced lung injury，VILI)是一个潜在威胁患者生命安全的并发症，其早已受到许多医学学者的关注。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain 3,NLRP3)炎症小体是先天免疫系统的重要组成部分，在炎性相关疾病发生过程中起重要作用。研究已证实，NLRP3炎症小体通过介导Caspase-1的激活及促炎细胞因子IL-1β/IL-18的分泌，参与了急性肺损伤的发生发展过程，提示对NLRP3炎症小体干预可能成为治疗VILI的潜在靶点。柚皮素(naringenin，NAR)是一种主要存在于柚子等柑橘类水果中的二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、心脏保护等多种潜在生物活性。Zhao et al报道，NAR可通过抑制炎症反应、提高抗氧化能力，改善脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤，但NAR是否对VILI具有改善作用目前还不明确。该研究拟通过机械大潮气量通气法建立VILI小鼠模型，探讨NAR干预对小鼠VILI的影响及其相关作用机制，以期为NAR的临床应用和VILI的防治提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1

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1 实验动物

60只雄性C57BL/6小鼠为SPF级，6～7周龄，体质量18～22 g，购自湖南省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0015。适应性饲养1周后用于正式实验，维持12 h/12 h明暗交替照明，自由饮水、进食。

1

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2 主要试剂与仪器

NAR标准品(纯度≥98%，批号：N107455)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speckle-like protein，ASC)和GAPDH抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司；电子天平购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；全自动酶标仪购自美国MD公司；i-STAT1型血气分析仪购自美国雅培公司；凝胶成像仪、实时荧光定量PCR仪购于美国BIO-RAD公司。

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3 方法

1

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3

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1

动物造模、分组与给药 将60只C57BL/6小鼠随机分成4组，每组15只，分别为假手术组(sham组)、机械通气模型组(Model组)、NAR低剂量组(L-NAR组)和NAR高剂量组(H-NAR组)。于造模前7 d开始灌胃给药，L-NAR组小鼠给予15 mg/kgNAR灌胃，H-NAR组给予60 mg/kg NAR灌胃，Sham组和Model组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，连续7 d。随后采用机械大潮气量通气法建立VILI模型：腹腔注射3%的戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉小鼠，采取仰卧位固定后，在颈部正中切口使气管暴露，切开气管，将24 G留置针缓缓置入并固定，接小动物呼吸机行机械通气(通气频率80次/min，VT 40 ml/kg，FiO21%，I ∶E=1 ∶2)，持续机械通气4 h后处死小鼠，收集样本检测。

1

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3

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2

动脉血液氧合指数(oxygenation index，OI)测定 各组小鼠机械通气插管即刻及机械通气4 h结束后采集颈内动脉血样，立即进行血气分析，记录动脉血氧分压(PaO)，根据吸入气中的氧浓度分数(FiO)计算OI，OI=PaO/FiO。

1

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3

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3

ELISA检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中TNF-α、IL-1β和IL-18的含量 机械通气结束后，结扎各组小鼠右肺主支气管，用预冷的PBS灌洗支气管肺泡，反复灌洗3次并收集BALF，按照试剂盒说明书进行操作，采用ELISA法检测BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量。

1

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3

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4

肺组织湿重/干重比值(wet weight/dry weight，W/D)测定 取各组小鼠右肺称取湿重，置于70 ℃干燥箱中烘干至恒重，称取干重，计算W/D值。

1

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3

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5

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察肺组织病理变化并评分 收集各组小鼠左肺组织，经0.9%氯化钠溶液洗净后于4%多聚甲醛溶液固定48 h，常规石蜡包埋，石蜡切片(3～4 μm)，行HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理改变，并参照林新 等的方法对肺损伤程度进行评分：从肺泡水肿、肺间质水肿、中性粒细胞浸润、肺泡充血四个方面评定，损伤程度由轻到重依次标记为0、1、2、3、4分，累计总分为最终损伤评分。

1

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3

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6

RT-PCR检测小鼠肺组织中

Caspase

-1 等mRNA水平 取各组小鼠的适量左肺组织，按照TRIzol法提取各样本的总RNA，测定总RNA浓度和纯度。根据逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增反应。PCR反应条件为95 ℃预变性60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。以

GAPDH

为内参，采用2法计算

NLRP

3、

ASC

和

Caspase

-1 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1

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3

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7

Western blot检测肺组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达水平 取各组小鼠的适量左肺组织称量，BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移至PVDF膜，室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，洗膜加入一抗(NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH，1 ∶1 000)，4 ℃过夜，次日洗膜后加入HRP标记的二抗(1 ∶1 000)，室温孵育1 h, 洗膜后滴加ECL显色液，并置于凝胶成像仪中显影、拍照。利用Image J图像分析软件进行分析，以目的条带与GAPDH的灰度值比值，作为目的蛋白表达的相对水平。

2 结果

2.1 NAR对VILI小鼠BALF中相关炎症因子含量的影响

与sham组比较，Model组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量增加，差异有统计学意义(

t

=14.439、21.233、16.054，

P

<0.01)；与Model组比较，H-NAR组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量减少，差异有统计学意义(

t

=12.394、10.771、13.495，

P

<0.01)，而L-NAR组差异无统计学意义。见图1。

图1 各组小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量比较 与sham组比较：**P<0.01；与Model组比较：##P<0.01

2.2 NAR对VILI小鼠肺组织W/D以及血液OI的影响

与sham组比较，Model组小鼠肺组织W/D值增加，OI值较插管即刻降低，差异有统计学意义(

t

=43.405、32.309，

P

<0.01)；与Model组比较，H-NAR组大鼠肺组织W/D值降低，OI值较插管即刻增加，差异有统计学意义(

t

=28.334、25.459，

P

<0.01)，而L-NAR组差异无统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠肺组织W/D和血液OI比较

2.3 NAR对VILI小鼠肺组织病理学的影响

sham组小鼠肺组织结构完整，未见明显异常；Model组和L-NAR组小鼠肺组织结构严重破坏，肺泡及间质内可见明显的渗出性水肿，肺间质伴有大量炎症细胞浸润，部分肺泡腔伴有出血；H-NAR组小鼠肺组织结构相对完整，肺泡和间质肿胀程度明显减轻，较少炎症细胞出现，肺泡出血不明显。见图2。与sham组比较，Model组肺损伤评分增加，差异有统计学意义(

t

=20.328，

P

<0.01)；与Model组比较，H-NAR组评分降低，差异有统计学意义(

t

=14.954，

P

<0.01)，而L-NAR组差异无统计学意义。

图2 各组小鼠肺组织病理学观察 HE染色 ×200

2.4 NAR对VILI小鼠肺组织中NLRP3炎症小体通路的影响

与sham组比较，Model组小鼠肺组织中

NLRP

3、

ASC

、

Caspase

-1的mRNA(

t

=22.394、34.105、59.580，

P

<0.01)和蛋白(

t

=45.495、29.337、23.556，

P

<0.01)表达水平增加，差异有统计学意义；与Model组比较，H-NAR组

NLRP

3、

ASC

、

Caspase

-1的mRNA(

t

=18.758、20.377、22.241，

P

<0.01)和蛋白(

t

=33.400、13.438、17.549，

P

<0.01)表达水平降低，差异有统计学意义，而L-NAR组差异无统计学意义。见图3。

图3 各组小鼠肺组织中Caspase-1、ASC和NLRP3 mRNA和蛋白表达水平比较

3 讨论

机械通气是维持急性呼吸衰竭患者生存的重要干预手段，但也是导致相关肺损伤的重要原因。许多学者认为，VILI的发生机制主要是由于机械地过度刺激，导致肺细胞内炎症与相关信号转导通路被激活，引起肺组织水肿、肺泡断裂，炎性细胞、炎症介质及细菌通过受损屏障释放入血，导致全身炎症反应，形成肺损伤。目前，临床上治疗VILI的药物主要有抗感染细胞因子药物、抗氧化剂、环氧化酶抑制剂及肌肉松弛药等，关于使用中药预防VILI的相关研究还鲜有报道。有研究已证实，NAR对急性肺损伤具有保护作用，由此推测NAR可能对VILI具有一定的改善作用。本研究通过构建VILI小鼠模型，探讨NAR对VILI的影响及其可能机制。研究结果显示，NAR能有效改善VILI的肺损伤程度，减轻肺组织炎症反应，其作用机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体通路的激活来实现的。

VILI的病理改变主要为肺泡间隔增厚、肺水肿、炎症细胞浸润等。本研究采用大潮气量(V=40 ml/kg)机械通气制备VILI小鼠模型，HE染色结果显示模型组小鼠肺组织发生明显病理学改变：肺组织结构紊乱，肺泡间隔增厚，肺间质水肿，肺血管旁、肺泡间隔和肺泡内都有大量炎性细胞浸润。同时肺组织W/D升高，而血液OI降低，与前人研究结果一致。HE染色结果提示小鼠VILI模型制备成功。采用高剂量NAR预处理后再进行VILI操作，可观察到小鼠肺组织病理损伤减轻，肺组织W/D比值下调，血液OI上升，这些研究结果提示NAR预处理可减轻小鼠VILI。

目前认为，失控性炎症反应是导致VILI的启动因素，而阻断炎症反应被认为是治疗VILI的潜在靶点。NLRP3炎症小体是由NLRP3蛋白、ASC和Caspase-1组成的大分子多蛋白复合体，通过诱导下游促炎性因子IL-1β和IL-18的成熟和释放，加剧炎症反应，参与VILI的发生发展。Wan et al通过基因敲除的方法证实，敲除VILI小鼠的香叶基香叶基二磷酸合酶1(GGPPS1)，可显著降低小鼠BALF中IL-1β和IL-18表达水平，减轻肺组织病理损伤。为进一步探究NAR改善VILI的可能机制，本研究对各组小鼠BALF中炎性因子含量以及肺组织中NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达水平进行了检测，研究结果显示，高剂量NAR可降低VILI小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18含量，同时抑制

NLRP

3、

ASC

和

Caspase

-1的mRNA及蛋白表达，该研究结果提示NAR可能通过抑制NLRP3炎症小体活化，减少TNF-α、IL-1β和IL-18的分泌，降低肺部炎症反应，从而发挥改善VILI的作用。

综上所述，NAR预处理可减轻VILI，其作用机制可能与抑制肺组织炎症反应和NLRP3炎症小体活化有关。该研究结果可为VILI临床治疗药物的研发提供实验依据。