高脂饮食对大鼠海马形态及突触相关蛋白Synapsin-1表达的影响

刘 森，陈 征，高欣冉，彭 磊，葛金芳

高脂血症是一种临床常见的脂质代谢紊乱综合征，其病因为脂肪代谢或转运异常导致血液中单种或多种脂质水平明显升高，主要表现为高胆固醇血症、高三酰甘油血症或混合型高脂血症。虽然大多数高脂血症患者初期并无明显的临床症状，但高脂血症已被证明是心脑血管疾病发生的独立危险因素，并与包括阿尔茨海默病在内的多种神经精神疾病密切相关。课题组前期研究表明，高脂饮食不仅可诱导大鼠糖脂代谢紊乱，还可导致以学习记忆能力下降为主要表现的神经精神行为异常，但具体机制尚未完全明确。

该研究拟采用高脂饮食喂养方法建立大鼠模型，进而观察大鼠海马形态及突触相关蛋白Synapsin-1(Syn-1)表达的改变，旨在为进一步阐明高脂血症诱导神经精神损伤的发生机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

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实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(160±10)g，购买于安徽医科大学动物中心，饲养条件为12 h/12 h昼夜交替光照，温度20～24 ℃，湿度45%～75%，适应性饲养1周之后开始实验。

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主要试剂 高脂饲料和标准饲料购于南通特洛菲饲料科技公司；水合氯醛购自北京索莱宝生物科技公司；HE染液和硝酸银试剂购自武汉塞维尔生物科技公司；Syn-1一抗购自美国immunoway公司。

1.2 方法

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大鼠分组 将18只SD大鼠随机分配至对照组及模型组，其中对照组8只，模型组10只。模型组大鼠予以高脂饲料(每公斤含猪油301 g、酪蛋白267 g、糊精157 g、蔗糖89 g、纤维素67 g、矿物质66 g、豆油33 g、维生素13 g)喂养，对照组大鼠予以标准饲料喂养。所有大鼠均自由饮食。

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大鼠血清的采集与生化检测 大鼠喂养4周后，用质量分数为10%的水合氯醛对其进行腹腔注射，待其完全麻醉后采用腹主动脉取血法采集血液标本。采用化学发光法检测血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)的水平；采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测瘦素浓度。

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大鼠脑组织取材 大鼠采集血液样本后放干其体内剩余血液，在各组中随机选取4只大鼠断头取全脑，用4%多聚甲醛固定备用。另有4只大鼠取脑之后在冰上快速分离出海马组织并放入液氮中快速冷冻，随即转移至-80 ℃冰箱中保存。

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脑HE染色 将4%多聚甲醛固定后的脑组织用梯度乙醇进行脱水处理，二甲苯脱脂透明，再用石蜡包埋，制成蜡块，6 μm连续切片，经二甲苯以及梯度乙醇脱蜡至水后进行HE染色，脱水透明，再采用中性树胶将切片封存，最后进行显微镜观察并采集图像。

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脑镀银染色 石蜡切片(6 μm)脱蜡至水后进行硝酸银染色：用免疫组化笔对组织描圈后滴加5%的硝酸银于组织上，湿盒反应20 min；再用蒸馏水清洗2次，即时配制银氨溶液滴加于组织上，避光作用15 min；将切片浸泡于稀氨水，配制并取适量显影液与组织反应5 min左右，在显微镜下观察显色反应，当神经纤维呈现黑色时，将显影液倒去并用蒸馏水冲洗2次；将显色后的切片用5%的硫代硫酸钠处理5 min，对切片进行脱水封存，在显微镜下观察并进行图像采集。

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qRT-PCR法检测海马中Syn-1mRNA的表达水平 从分离的海马组织中提取总mRNA，进行逆转录得到cDNA，采用qRT-PCR仪对Syn-1进行扩增。扩增体系共10 μl，其中SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus) (2×)5.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μl，cDNA3.0 μl，无酶DEPC水1.4 μl。反应条件：95 ℃预变性3 min，随即进行PCR循环，循环条件为95 ℃反应10 s，55 ℃反应30 s，总共进行40次循环。Syn-1及内参β-actin的引物序列见表1。采用2法定量分析Syn-1的表达水平。

表1 Syn-1和内参β-actin引物序列

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免疫组织化学染色 大鼠脑组织用4%多聚甲醛固定，经30%蔗糖进行脱水、石蜡包埋后进行6 μm切片。采用枸椽酸钠进行高温修复后，使用过氧化氢对内源性过氧化物酶进行阻断，使用Syn-1抗体(1 ∶1 000)在4 ℃条件下孵育过夜。次日用PBS缓冲液洗涤，用HRP 标记的二抗在室温下孵育1 h，用DAB显色液显影后进行显微镜观察并拍照，并使用Image Pro Plus 6.0软件对免疫组织化学结果图中阳性棕褐色产物进行定量分析。

2 结果

2.1 高脂饮食对大鼠血清脂质水平的影响

与对照组相比，模型组中大鼠血清TC、HDL、LDL水平升高，且瘦素水平下降，差异有统计学意义(

P

<0.01)，而TG水平有一定的升高趋势，但两组间比较无统计学差异。见表2。

表2 高脂饮食对大鼠血清脂质浓度的影响

2.2 高脂饮食对大鼠海马形态学的影响

HE染色结果表明，对照组海马CA1、CA3及DG区的神经元细胞形态正常，分布紧密，细胞核圆且大，并且能够清楚地看到核仁，切片中无深染的神经元。高脂饮食模型组各区中神经元细胞分布松散，且萎缩变形，细胞核与胞浆之间的界限不明，并且大量细胞已变性，在切片处出现细胞核固缩、深染，见图1。镀银染色结果显示，对照组海马CA1、CA3及DG区神经元细胞分布疏松且整齐，未见神经元深染，而高脂饮食模型组中海马各区神经元细胞深染，排列紧密无序，且神经元细胞发生大量变性，见图2。

图1 高脂饮食对大鼠海马CA1、CA3、DG区形态学的影响 HE染色 ×100

图2 高脂饮食对大鼠海马CA1、CA3、DG区形态学的影响 镀银染色 ×100

2.3 高脂饮食对大鼠海马组织中Syn-1 mRNA表达的影响

采用qRT-PCR法检测两组大鼠海马组织Syn-1 mRNA表达情况，结果如图3所示。与对照组比较，模型组海马组织的Syn-1 mRNA的表达量降低，差异有统计学意义(

t

=2.612，

P

=0.021)。

图3 高脂饮食对大鼠海马Syn-1 mRNA表达的影响与对照组比较：*P<0.05

2.4 高脂饮食对大鼠海马组织中Syn-1蛋白表达的影响

本研究中免疫组织化学染色后海马组织中

出现明显深棕色或棕褐色颗粒为Syn-1蛋白表达阳性。在对照组中，Syn-1棕褐色阳性产物主要表达在在海马CA1、CA3、DG区中，且棕褐色颗粒样物质数量较模型组多且颜色更深。模型组CA1、CA3、DG区中Syn-1免疫阳性产物表达较对照组降低，两组之间差异有统计学意义。见图4、5。

图4 高脂饮食对大鼠海马Syn-1蛋白表达的影响 免疫组织化学染色 ×100

3 讨论

高脂饮食在基础研究中常用于构建糖尿病、高脂血症以及非酒精性脂肪肝等多种动物模型。研究表明，血脂异常，尤其是胆固醇水平的升高会增加淀粉样蛋白的聚集，继而加速阿尔茨海默病等神经精神疾病的发生发展。本课题组前期研究结果表明高脂饮食不仅能够诱导大鼠出现高糖血

图5 脂饮食对大鼠海马CA1、CA3、DG区Syn-1蛋白表达的影响与对照组比较：**P<0.01

症、高脂血症等代谢紊乱表现，还可导致其学习记忆功能障碍等神经精神行为学异常。与上述结果相一致的是，本研究结果表明，高脂饮食连续喂养4周可导致大鼠血清TC、LDL浓度升高，瘦素水平下降；与此同时，模型组大鼠血清HDL浓度也较对照组显著上升；这可能是机体的代偿性反应，也可能是高脂血症发展过程中不同病程的变化。

研究表明，高脂饮食不仅可诱导大鼠糖脂代谢紊乱，还可导致中枢神经系统的形态学改变。海马作为边缘系统的重要组成部分，是公认的与学习记忆等功能密切相关的脑区，在学习记忆和情感等方面起着极为重要的作用。本研究中的镀银染色结果表明，模型组海马CA1、CA3及DG区神经元细胞发生明显萎缩，并且出现大量变性；结果提示海马脑区内神经元的异常变性可能为高脂饮食诱导大鼠发生学习记忆功能障碍的原因之一。

突触可塑性是神经元突触能够健康有序地发生变化，从而使得神经元形成完整的功能性回路，是大脑学习记忆功能的分子生物学基础。作为参与突触可塑性调节的主要蛋白之一，Syn-1能够与钙离子的结合从而参与突触囊泡融合以及神经递质释放，在认知功能的调节中发挥重要作用。研究表明，阿尔茨海默病患者痴呆前期，血浆中神经元来源的外泌体中的Syn-1的表达显著降低并与认知功能下降密切相关。并且Joshi et al的研究表明经过连续用抗精神病药物两周的大鼠海马中Syn-1的表达显著升高，这一结果提示海马内Syn-1的表达水平可能与神经精神损伤程度成负相关。在本研究中，qRT-PCR及免疫组织化学结果表明模型组大鼠海马中Syn-1表达相较于对照组明显下降，这一结果与各组海马镀银染色形态学观察结果提示海马脑区的结构及突触可塑性改变可能是高脂饮食诱导神经精神损伤的神经生物学机制之一。

综上所述，高脂饮食不仅能够诱导大鼠脂质代谢紊乱，还可导致海马区域神经元结构和功能的异常变化。海马形态学改变及Syn-1表达下调可能是高脂饮食诱导神经精神损伤的可能机制。