水稻OsHSP40基因可变剪接体鉴定及表达分析

喻锦莉，刘长爱，符 霖，王 鑫，欧阳解秀

(南昌大学 生命科学学院，江西省分子生物学与基因工程重点实验室，江西 南昌 330031)

可变剪接(Alternative splicing，AS)又称为选择性剪接，指单个mRNA前体(pre-mRNA)通过不同的剪接方式产生多个成熟的mRNA，是一种典型的转录后调控方式[1-2]。在真核生物中，基因的AS过程有助于丰富蛋白质的多样性；另外，与宿主基因共转录内含子miR400降低pri-miR400的加工效率和成熟miR400的表达[3]。基因的可变剪接在植物发育、生理代谢、环境胁迫及植物抗病中发挥重要作用[4-5]。研究发现，内含子促进miR528的产生，同时转录本中3′片段缩短可以对miR528产生正向调控，通过影响miR528基因的转录或miR528转录本的可变剪接，从而影响到水稻开花[3]。高温影响OsbZIP58的可变剪接，促进了全长OsbZIP58α蛋白形式转变成截短的OsbZIP58β蛋白形式，来提高灌浆期间水稻耐热性[6]。OsLG3b区域的6个SNPs导致其选择性剪接，从而影响水稻籽粒的粒长[7]。

热激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一类进化上非常保守的蛋白，在真核和原核生物中广泛存在，具有保护机体免受非生物胁迫的危害功能[8-9]。根据分子量、系统发育同源性和功能，HSPs通常被分为5个亚科，分别是小热激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。其中，sHSPs是指蛋白分子量为15～42 ku的一类热激蛋白，研究显示sHSPs的表达受到高温、盐、干旱等多种逆境的影响来发挥生物学功能[11-12]。另外，sHSPs还可以作为在拟南芥中，过量表达AtHSP17.6A提升了拟南芥对盐和干旱的耐受性[12]。过表达JrsHSP17.3提高转基因核桃植株对盐和耐热耐寒的性能[13]。

水稻作为世界重要的粮食作物，其产量受到高温、盐、干旱等非生物胁迫的影响[9，14]。在水稻中鉴定到23个sHSPs，通过RT-PCR分析发现大部分sHSPs的表达受到高温胁迫的影响[15]。Sato等[16]研究发现，在水稻中过量表达OsHSP17.7，有效提高植株对UV-B、干旱和热胁迫的耐受性。OsHsp18.0过表达株系对细菌性条斑病的抗性增强，而抑制株系的抗性下降[17]。在大肠杆菌和毕赤酵母细胞中的异源表达OsHSP20增强了其对热盐胁迫的耐受性。组成性过表达OsHSP20的转基因水稻植株在热、盐处理条件下根长和发芽率高于对照植株[18]。目前，关于水稻中sHSPs的生物学功能报道较少。

在Phytozome数据库(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中发现sHSPs的另一个成员OsHSP40，通过生物信息学分析发现，该基因具有不同的可变剪接。前期研究发现该基因的表达受到盐胁迫的影响[9]，但是该基因生物学功能鲜有报道，有待于进一步研究。本研究根据生物信息学分析结果设计特异性引物，以中花11为材料，利用RT-PCR和TA克隆技术对OsHSP40基因的不同剪接本进行鉴定，以确定其存在的可变剪接体，为后续深入研究该基因在水稻生长发育和逆境适应过程中的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

试验用的植株材料为粳稻中花11(ZH11)由江西省分子生物学与基因工程重点实验室提供。超薄DNA产物纯化试剂盒和DNA割胶回收试剂盒(TIANGEN)、金牌Mix(TSINGKE)、TransTaq HiFi DNA聚合酶(TRAN)。

1.2 试验菌株及载体

大肠埃希菌DH5α(上海唯地生物技术有限公司)、PMD18-T(TaKaRa)。

1.3 引物设计

在Phytozome网站(https：//phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html)分别下载水稻OsHSP40可能存在的不同剪接体的参考序列，并编号为1～4号可变剪接体(表1)，根据这些可变剪接体的序列特征，设计特异的RT-PCR引物(表2)。

表1 水稻OsHSP40基因可能存在的4种可变剪接体Tab.1 Four putative splice variants of rice OsHSP40

1.4 样品逆境处理

参考文献[19-20]报道的试验方法：选取生长21 d的ZH11幼苗进行150 mmol/L盐处理，处理后3，6，9 h进行取样，并迅速冻于液氮中后-80 ℃保存。选取生长21 d的ZH11幼苗进行42 ℃高温处理，处理后2，4，6，8，12，24 h进行取样，并迅速冻于液氮中后-80 ℃保存。不同水稻组织样品经液氮研磨成粉末，采用TRIzol法提取水稻不同组织的总RNA。按照TIANGEN 的反转录试剂盒(TIANGEN)说明书合成cDNA第一链[9]。

1.5 RT-PCR

以叶片或者其他组织的cDNA为模板，利用DNA聚合酶和表2中的特异性引物对OsHSP40基因的不同剪接本进行扩增。经DNA割胶回收或者超薄回收获得目的产物后，进行TA克隆[21]。

1.6 TA克隆

根据试剂盒说明将纯化得到的目的片段与pMD8-T载体进行连接，采用10 μL体系16 ℃连接30 min。连接体系包含5 μL目的片段、0.5 μL载体和4.5 μL Solution I。转化大肠杆菌，进行抗性筛选，获得阳性克隆进行测序验证。

表2 引物信息Tab.2 Information of primers

2 结果与分析

2.1 OsHSP40基因可变剪接体及其RT-PCR特异引物位置

根据Phytozome(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)网站数据，OsHSP40预测存在4种不同的剪接体，分别命名为OsHsp40.1、OsHsp40.2、OsHsp40.3和OsHsp40.4，不同可变剪接体如图1-A所示。预测显示，OsHSP40基因可变剪接体的CDS序列长度分别是1 230，1 227，1 155，1 125 bp(表1)，1号可变剪接体比2号可变剪接体在第1个外显子中多3个碱基(AGC)。3号可变剪接体是由于引物e所在位置成为外显子，4号可变剪接体则是由于引物d所在位置转变成为外显子。根据OsHSP40基因不同可变剪接体的序列及结构特征设计RT-PCR扩增的特异性引物(图1-A、表2)。

2.2 OsHSP40基因可变剪接体扩增及克隆

利用野生型ZH11的cDNA为模板，采用特异性引物组合进行RT-PCR扩增，首先，采用引物b/e组合进行PCR扩增，电泳检测后具有清晰约100 bp大小的电泳条带，说明3号剪接体可能存在(图1-B)；引物b/d组合扩增后具有约150 bp的电泳条带(图1-C)，说明剪接体4可能存在，将扩增获得的目的产物测序，进一步验证了可变剪接体3和4的存在；最后利用引物a/c组合PCR扩增后具有清晰的电泳条带(图1-D)，说明OsHSP40基因的1、2和4号可变剪接体可能存在，由于OsHSP40可变剪接体1和2相差3个碱基(AGC)，故对引物a/c组合的扩增产物进行TA克隆，对阳性菌落进行测序验证，对测序结果分析发现，测序获得样品中有12个单菌落克隆为1号可变剪接体，只有1个为2号可变剪接体，这一结果表明，OsHSP40基因的1号可变剪接体的表达量可能远高于2号可变剪接体。综上，成功鉴定到OsHSP40的4种可变剪接体。

2.3 OsHSP40可变剪接体表达分析

为了研究OsHSP40的生物学功能，选取野生型水稻ZH11不同组织部位，包括根、茎和叶，利用RT-PCR对OsHSP40不同可变剪接体的表达模式进行分析。发现，OsHSP40(OsHsp40.1234)基因在ZH11根、茎和叶中均表达，呈组成型表达；OsHSP40可变剪接体4(OsHsp40.4)在所检测的ZH11根、茎和叶中表达，在叶片中的表达量高于其在根和茎中的表达量(图2)。这一结果表明，OsHSP40不同的可变剪接体表达模式可能存在差异。

2.4 高盐条件下OsHSP40可变剪接体表达分析

前期研究发现，该基因的表达受到盐胁迫的影响[9]，不同OsHSP40可变剪接体在高盐胁迫过程中响应是否存在差异，采用3周龄的ZH11幼苗进行150 mmol/L盐溶液处理，处理后3，6，9 h分别取地上和地下部分的组织进行表达分析，结果发现(图3)，在未处理时可变剪接体4(OsHsp40.4)在地上和地下部分中的表达量均显著低于OsHSP40的表达，该结果进一步证实OsHSP40基因存在可变剪接体4(OsHsp40.4)；高盐处理后，在地上部分的组织中，可变剪接体4(OsHsp40.4)的表达量上升，处理9 h后最高，但上升幅度低于OsHsp40.1234。在地下部分的组织中，处理6 h后OsHsp40.1234的表达显著升高达到峰值，9 h后下降；可变剪接体OsHsp40.4的表达则在处理3 h开始上升，处理9 h后高于其他时期。这一表达结果显示，OsHSP40基因及其可变剪接体的表达受到高盐胁迫的诱导，高盐条件下OsHsp40.4与OsHsp40.1234的表达方式存在一定的差异。

2.5 高温条件下OsHSP40可变剪接体表达分析

热激蛋白(HSPs)是指当细胞或生物体遭受高于其正常生长所需温度8～12 ℃时，在几小时、甚至几分钟内会新合成一类蛋白质。不同OsHSP40可变剪接体在高温胁迫过程中响应是否存在差异，采用3周龄的ZH11幼苗进行42 ℃处理，处理后2，4，8，12 h分别取地上和地下部的组织进行表达分析结果发现，在水稻幼苗地上组织中，OsHsp40.1234基因在处理后2 h表达变化不显著，处理后4 h，其表达显著上升，处理后的4～12 h表达量都显著升高；而剪接体OsHsp40.4的表达则处理2 h后开始上升，一直到处理后12 h达到最高。在地下组织中OsHsp40.4和OsHsp40.1234的表达在处理后2 h显著上升，处理后8 h达到最高，处理后12 h表达上升幅度降低(图4)。

3 结论与讨论

基因的可变剪接在真核生物中广泛存在，在植物发育、生理代谢、环境胁迫及植物抗病反应中发挥重要作用[4-5]。水稻FLO10功能缺失会影响线粒体nad1基因内含子1的反式剪接，导致nad1外显子1和外显子2-5前体的积累，FLO10在维持线粒体功能和胚乳发育中起重要作用[22]。OsLG3b基因8外显子上的碱基替换引起一个可变剪接，导致转录提前终止，进而产生了一个C端截短了的蛋白质，调控籽粒长度增长[7]。利用RT-PCR与TA克隆实验，成功的分离鉴定到OsHSP40基因的4种不同可变剪接体，在进行TA克隆测序过程中，发现1号可变剪接体转录水平可能高于2号可变剪接体。

植物热激蛋白是高度保守的蛋白质分子家族，起到分子伴侣、热防御和稳定细胞结构等功能。根据其表达的条件及作用可分为两类：在胁迫条件下表达的应激热激蛋白；在生物体整体条件下存在表达，应激时表达量增加的组成型热激蛋白[23]。本研究发现，OsHSP40在检测的根、茎、叶中均表达，说明该基因可能属于组成型热激蛋白。非生物胁迫下，植物的HSP基因具有时空调控作用，其表达受到各种非生物胁迫的影响[24]。试验显示，OsHSP40在盐胁迫和高温胁迫条件下，表达量上升，说明该基因的表达受到盐和高温胁迫的诱导表达。根据分子量、系统发育同源性和功能，HSPs通常被分为5个亚科，分别是小热激蛋白(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100s家族[10]。分析预测显示，OsHSP40蛋白大小约40 ku，说明其属于sHSPs家族成员。

基因的可变剪接在植物发育及适应胁迫反应中发挥重要作用，基因选择性剪接在维持水稻矿质营养稳态中起着重要作用[25]。基因可变剪接有助于水稻保持系HuHan2B抗旱性的遗传改良[26]。水稻不同OsGATA转录因子在非生物胁迫信号传导过程中发挥重要作用，同时OsGATA基因剪接变异在不同环境条件下紧密调控[27]。OsGBF1存在多种可变剪接变体，这些剪接体在水稻中可能具有特异性的抗逆性功能[28]。在水稻幼苗地上组织中，OsHSP40基因在高温处理后2 h表达变化不显著，处理后4 h，其表达显著上升；而剪接体OsHsp40.4的表达则处理2 h后开始上升，一直到处理后 12 h达到最高。高盐条件下OsHsp40.4与OsHsp40.1234的表达方式存在一定的差异。说明OsHSP40基因的可变剪接体可能在高盐和高温胁迫过程中的发挥存在一定的差异。