lncRNA CBR3-AS1靶向调控miR-5195-3p促进胃癌细胞增殖、迁移及侵袭

刘 亮，刘洪涛，李医明

北部战区总院普通肝胆外科，辽宁 沈阳 110016

胃癌是临床常见的一种恶性肿瘤，近年来，胃癌发病率逐年上升，其主要类型为腺癌，胃癌细胞转移是导致患者死亡率增加的重要原因[1-3]。目前胃癌细胞侵袭及转移的分子机制尚未完全阐明，lncRNA在胃癌组织或细胞中表达异常而调控细胞增殖、迁移等生物学过程从而参与胃癌发生及发展过程[4]。lncRNA CBR3-AS1在胆管癌中表达上调，其表达量与患者临床病理特征密切相关[5]。通过生物信息学分析显示miR-5195-3p可能是CBR3-AS1的靶基因，miR-5195-3p在骨肉瘤细胞中表达下调，上调其表达可抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡[6]。但CBR3-AS1是否通过调控miR-5195-3p的表达从而参与胃癌发生及发展过程尚未知。因此，本研究主要探讨CBR3-AS1对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探究其对miR-5195-3p的靶向调控作用，旨在为进一步揭示胃癌细胞迁移及侵袭的分子机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂正常胃上皮细胞GES-1与胃癌细胞系HGC-27、NCI-N87、AGS(美国ATCC细胞库)。杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；Trizol试剂(北京全式金生物技术有限公司)；反转录与qRT-PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；CBR3-AS1小分子干扰RNA(si-CBR3-AS1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-5195-3p寡核苷酸模拟物(miR-5195-3p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-5195-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-5195-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC)(上海吉玛制药技术有限公司)；MTT、细胞凋亡试剂盒(美国Sigma公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：GES-1、HGC-27、NCI-N87、AGS细胞常规培养于DMEM完全培养基，选取对数生长期胃癌细胞AGS(1×108个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别将si-NC、si-CBR3-AS1、si-CBR3-AS1与anti-miR-NC、si-CBR3-AS1与anti-miR-5195-3p转染至AGS细胞，分别记作si-NC组、si-CBR3-AS1组、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组、si-CBR3-AS1+anti-miR-5195-3p组，转染6 h后将培养基更换为含有血清的培养基，转染48 h后收集细胞。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表达水平：收集GES-1、HGC-27、NCI-N87、AGS细胞及转染后的AGS细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA。应用Nanodrop 2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。将总RNA合成cDNA。CBR3-AS1正向引物:5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，反向引物:5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；miR-5195-3p正向引物:5′-CAGAGAACAACATGGGAGCG-3′，反向引物:5′-ACTACGATCGATCTGACTGCA-3′；U6正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH正向引物:5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。qRT-PCR反应体系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。CBR3-AS1以GAPDH为内参，miR-5195-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算CBR3-AS1、miR-5195-3p的表达水平。

1.2.3 MTT检测细胞增殖：收集各组对数生长期AGS细胞接种于96孔板(5×104个/孔)，每孔加入20 μl MTT溶液(质量浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h，弃上清，加入150 μl DMSO，室温振荡孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值(OD值)，细胞活力(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭：细胞迁移实验：收集各组AGS细胞(5×104个/ml)接种于Transwell小室的上室(200 μl/孔)，Transwell小室的下室加入600 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养液，继续培养24 h，PBS洗涤，依次分别进行多聚甲醛固定(20 min)与结晶紫染液染色(10 min)，PBS洗涤后观察迁移细胞数。细胞侵袭实验：稀释Matrigel基质胶(预冷培养基)，将Matrigel基质胶稀释液分别加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，室温孵育5 h，后续实验步骤同细胞迁移实验，观察侵袭细胞数。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测CBR3-AS1的靶基因：starBase预测显示CBR3-AS1与miR-5195-3p存在结合位点，分别构建野生型载体WT-CBR3-AS1、突变型载体MUT-CBR3-AS1，将miR-NC、miR-5195-3p mimics分别与WT-CBR3-AS1、MUT-CBR3-AS1共转染至AGS细胞，转染24 h后收集细胞，检测各组荧光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达：收集各组AGS细胞，加入400 μl RIPA裂解液提取细胞总蛋白。参照BCA检测试剂盒测定蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉封闭2 h，分别加入E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)与内参GAPDH(1∶1 000)一抗稀释液，次日进行TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 胃癌细胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表达量比较与GES-1比较，胃癌细胞系HGC-27、NCI-N87、AGS中CBR3-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)，miR-5195-3p的表达水平显著降低(P<0.05)，其中CBR3-AS1在胃癌细胞AGS中的表达水平相对较高，因而选用胃癌细胞AGS进行后续实验(见表1)。

表1 胃癌细胞中CBR3-AS1、miR-5195-3p的表达量比较Tab 1 Comparison of expression levels of CBR3-AS1 and miR-5195-3p in gastric cancer cells

2.2 干扰CBR3-AS1表达对胃癌细胞AGS增殖、迁移及侵袭的影响与si-NC组比较，si-CBR3-AS1组细胞活力显著降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，差异均有统计学意义(见图1、表2)。

图1 Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达Fig 1 Western blotting was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin protein

表2 干扰CBR3-AS1表达对胃癌细胞AGS增殖、迁移及侵袭的影响Tab 2 Effects of interference with CBR3-AS1 expression on the proliferation,migration and invasion of gastric

2.3 CBR3-AS1靶向调控miR-5195-3pstarBase预测显示CBR3-AS1与miR-5195-3p存在结合位点(见图2)。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型载体WT-CBR3-AS1的细胞实验中，与miR-NC组比较，miR-5195-3p组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；共转染突变型载体MUT-CBR3-AS1的细胞实验中，miR-5195-3p组荧光素酶活性与miR-NC组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。与si-NC组比较，si-CBR3-AS1组miR-5195-3p的表达水平显著升高(P<0.05)(见表4)。

图2 CBR3-AS1的序列中含有与miR-5195-3p互补的核苷酸序列Fig 2 The sequence of CBR3-AS1 contained a nucleotide sequence complementary to miR-5195-3p

表3 双荧光素酶报告实验Tab 3 Double luciferase report experiment

表4 CBR3-AS1靶向调控miR-5195-3p的表达Tab 4 CBR3-AS1 targeted and regulated the expression of

2.4 干扰miR-5195-3p表达可降低干扰CBR3-AS1表达对胃癌细胞AGS增殖、迁移及侵袭的抑制作用与si-CBR3-AS1+anti-miR-NC组比较，si-CBR3-AS1+anti-miR-5195-3p组细胞活力显著升高(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数显著增多(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05)，差异均有统计学意义(见图3、表5)。

图3 Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达Fig 3 Western blotting was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin protein

表5 干扰miR-5195-3p表达可降低干扰CBR3-AS1表达对胃癌细胞AGS增殖、迁移及侵袭的抑制作用Tab 5 Interference with miR-5195-3p expression could reduce the inhibitory effect of interference with CBR3-AS1 expression on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cell AGS

3 讨论

胃癌发生及转移过程涉及多基因、多信号通路异常等，lncRNA表达异常可参与肿瘤发生及发展过程，还可调控细胞增殖、凋亡等多种生物信息学过程，其表达量异常还与胃癌患者临床病理学参数密切相关[7-11]。但仍有部分lncRNA在胃癌发生及发展过程中的作用机制尚未阐明，因而本研究积极探寻新型lncRNA并探究其可能调控机制，为胃癌的靶向治疗提供潜在靶点。

CBR3-AS1在骨肉瘤组织或细胞中表达上调，并可促进骨肉瘤发生及发展[12]。本研究结果显示，胃癌细胞系中CBR3-AS1的表达水平升高，提示CBR3-AS1在胃癌发生过程中可能发挥重要调控作用。研究表明上皮-间质转化(EMT)与肿瘤细胞迁移及侵袭密切相关，上皮细胞标志物E-cadherin表达上调可抑制EMT从而抑制肿瘤转移，间充质细胞标志物N-cadherin表达上调可促进EMT从而增强肿瘤转移能力[13]。本研究结果显示，干扰CBR3-AS1的表达后细胞活力显著降低，迁移细胞数和侵袭细胞数显著减少，E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低，提示干扰CBR3-AS1的表达可抑制胃癌细胞增殖，还可能通过调控EMT途径从而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

miR-5195-3p通过下调EIF4A2增强三阴性乳腺癌对紫杉醇的化学敏感性[14]。miR-5195-3p表达下调可促进卵巢癌细胞转移及肿瘤发生[15]。miR-5195-3p可抑制人非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及侵袭[16]。miR-5195-3p通过直接靶向癌基因KLF5抑制人膀胱癌细胞的增殖及侵袭[17]。本研究结果显示，胃癌细胞中miR-5195-3p的表达水平显著降低，进一步分析显示，CBR3-AS1可靶向结合miR-5195-3p，还可负向调控miR-5195-3p的表达，由此推测CBR3-AS1可能通过调控miR-5195-3p的表达从而影响胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。本研究将si-CBR3-AS1与anti-miR-5195-3p共转染至胃癌细胞，结果显示，细胞增殖、迁移与侵袭能力增强，并可抑制E-cadherin表达及促进N-cadherin表达，说明干扰miR-5195-3p表达可降低干扰CBR3-AS1表达对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。提示干扰CBR3-AS1表达可能通过上调miR-5195-3p的表达从而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。

综上所述，干扰CBR3-AS1表达可减弱胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，其作用机制可能通过靶向调控miR-5195-3p的表达而发挥作用，可为进一步揭示胃癌发生及转移的分子机制奠定实验基础，还可能作为胃癌靶向治疗的潜在靶点。但关于miR-5195-3p下游靶基因及其可能作用机制仍需进一步探究。