模拟战创伤对肠道细菌群落影响的研究

王子恺，李 甍，孙 菁，张 群，贺红艳，高 远，范开春

1.中国人民解放军总医院第一医学中心消化内科医学部，北京 100853；2.中国人民解放军总医院第二医学中心健康管理研究院国际部；3.中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部

战创伤的防治是军事医学的重要课题，平时创伤也是当今危害人类健康的重大疾患，创伤防治研究始终是临床医学和军事医学的重要课题[1-5]。肠道菌群可视为人体的“第八器官”，肠道微生态是人体最复杂的微生态系统。肠道菌群是肠黏膜屏障的重要组成部分，同时肠道是人体最大的储菌库和内毒素库，是严重创伤后合并感染的重要细菌和内毒素来源，是创伤后感染二次打击的起源[6-9]。战时当人体遭受各种复合伤、多发伤和烧伤等严重创伤时早期即可出现肠道内毒素及细菌繁殖、移位，进而激活机体单核巨噬细胞系统，导致细胞因子和炎症介质大量释放，从而引发严重的系统性或脏器感染、脓毒血症、系统性炎症反应综合征(SIRS)，甚至多器官功能障碍或衰竭[2，6，10-11]。现阶段，战创伤状态下肠道菌群结构和功能特征的研究较少[8，11-14]，前期虽然有一些基于传统培养等方法的创伤相关肠道菌群及其移位的研究，但受到方法学等的限制研究并不深入[10]。近年来，肠道微生态成为研究热点，特别是菌群高通量测序和生物信息学分析方法的不断发展，为研究严重创伤状态下肠道菌群结构及其功能提供了支撑。

本研究选择骨科收治的拟行手术治疗的大关节/骨盆骨折患者来模拟战创伤状态，并以同期健康查体人员作为健康对照组，开展粪便细菌群落16S rDNA高通量测序和生物信息学分析，明确战创伤早期肠道细菌群落变化特征，为战创伤相关肠道微生态理论和干预研究提供支撑。

1 资料与方法

1.1 研究对象以中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部收治的拟行手术治疗的大关节/骨盆骨折患者来模拟战创伤状态，纳入模拟战创伤组(T组)；以在中国人民解放军总医院第二医学中心健康管理研究院国际部进行健康查体的人员为健康对照组(H组)。T组纳入标准：拟行手术治疗的大关节/骨盆骨折的严重创伤患者；中国汉族人群；年龄18～70岁；男女不限；体质量指数(BMI)正常范围；化验和检查包括三大常规、生化、凝血、血清术前八项和骨科专科检查等；采集标本前3个月内未服用抗生素类、微生态制剂和其他影响肠道菌群的药物；既往无影响肠道菌群的手术史等；饮食生活规律。H组纳入标准：中国北方汉族人群，年龄18～70岁；男女不限；BMI正常范围；实验室化验和影像学检查等无明显异常；采集标本前3个月内未服用抗生素类、微生态制剂及其他影响肠道菌群的药物；饮食生活规律。T组和H组对象均自愿参加研究，并签署知情同意书。本研究获得中国人民解放军总医院伦理委员会批准(伦审第S2016-082-01号)。

1.2 样本采集及处理

1.2.1 粪便样本：利用大便取样管按1 g的标准用小匙取样；获取新鲜样本后2～6 h内冰袋转运至中国人民解放军总医院消化道微生态实验室进行分装，并置于-80 ℃冰箱保存备用。注意事项：T组和H组研究对象在样本采集前未接受任何影响肠道菌群的药物或其他医源性干预措施；粪便标本留存时间<24 h，切忌混入尿液及杂质等。

1.2.2 血液样本：T组和H组血液样本采集和化验项目按骨科和健康体检各专科要求实施，需包括白细胞、中性粒细胞、C反应蛋白、白介素-6、降钙素原等炎症指标。

1.3 粪便菌群总DNA提取采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行粪便细菌总DNA提取。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA的完整性和浓度质检。

1.4 16S rRNA PCR扩增及Illumina测序对质检合格的DNA使用引物为341F：5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′(引物中已带特定barcode)，扩增细菌16S rRNA的V3和V4区，得到500 bp左右的扩增片段。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，执行30个循环；最后72 ℃维持5 min。PCR反应体系为：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μl，引物(10 μm)各为1 μl，模板DNA为50 ng，加ddH2O补齐30 μl。

使用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒切胶回收PCR产物，文库质检合格后，采用Qubit 2.0进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合。本研究基于Illumina MiSeq PE300平台进行上机测序。采用PANDAseq软件通过重叠关系进行拼接，获得高变区的长reads(序列)。

1.5 数据处理16S序列被控制在220 bp和500 bp之间，保证每条reads平均质量值不低于20，且含N数不超过3个。将序列完全一样的Clean Reads根据其丰度大小进行排序，将其中的Singletons过滤掉。使用UPARSE根据97%相似度进行OTUs聚类，并使用Userach鉴定和移除嵌合体序列。每个OTU均有一个代表性的序列，使用RDP数据库，置信度阈值设置为0.8，利用RDP Classifer将每个代表性序列进行物种注释。不同样本对应的reads数量差距较大，为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差，我们在样品达到足够的测序深度的情况下，对每个样品进行随机抽平处理。测序深度用α多样性指数来衡量，α多样性指数通过QIIME的python脚本实现。

1.6 数据统计分析测序数据进行序列优化统计；OTUs分析包括聚类、抽平处理、Venn分析、物种积累曲线等；物种分类和丰度分析；α多样性分析包括OTUs、Shannon指数、Chao指数、Simpson指数等；主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)和多响应置换过程(multi response permutation procedure，MRPP)分析等用于β多样性分析；物种差异性分析采用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)方法实施，使用秩和检验等对不同分组之间进行显著性差异分析。

2 结果

2.1 主要人口学和临床指标分析本研究最终纳入符合标准的25例患者(T组)和35名健康个体(H组)。T组和H组在性别比例、年龄和BMI等人口学数据方面差异无统计学意义(P>0.05)。H组主要临床指标均在正常范围内；T组患者白细胞计数、中性粒细胞、C反应蛋白和白介素-6水平较H组升高明显，两组间差异有统计学意义(P<0.001)(见表1)，提示T组可较好模拟战创伤患者的创伤、炎症和应激状态。

表1 T组和H组主要人口学和临床指标分析Tab 1 Analysis of main demographic and clinical indexes in T group and H group

2.2 粪便菌群总体特征分析

2.2.1 测序数据统计和OTUs分析：本研究对T组和H组共60例粪便样本的细菌16S rRNA V3-V4区进行测序，得到可用于后续分析的有效数据共2 228 440条(平均37 141条)，有效序列的平均读长为417 bp。通过Observed species和Chao指数分析显示测序深度和数据量合理。本研究共得到646个OTUs，基于不同样本和不同组之间的OTUs数目绘制Venn图(见图1)，T组和H组的OTUs数目分别为583个和560个，共有的OTUs数目为497个。

图1 基于OTUs的Venn图分析Fig 1 Venn diagram analysis based on OTUs information

2.2.2 粪便相关菌群物种注释分析：本研究根据物种注释结果确定了粪便细菌群落相对丰度排名前10的菌门，包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、疣微菌门(Verru comicrobia)、广古菌门(Euryarchaeota)、互养菌门(Synergistetes)、暂定螺旋菌门(Candidatus Saccharibacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria/Chloroplast)(见图2)。同时明确了各组样本属水平的分布情况，其中相对丰度较高的菌属包括拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、埃希氏菌属/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)、巨单胞菌属(Megamonas)、罗氏菌属(Roseburia)、梭菌属XIVa(ClostridiumXIVa)、普拉梭菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、丁酸盐相关菌属(Lachnospiracea_incertae_sedis)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、巨球菌属(Megasphaera)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、另枝菌属(Alistipes)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Gemmiger、柯林斯氏菌属(Collinsella)、小杆菌属(Dialister)和丛毛单胞菌属(Comamonas)等(见图3)。

图2 两组粪便菌群主要门水平分布情况；图3 两组粪便菌群主要属水平分布情况Fig 2 Relative abundance of the most abundant phyla of fecal bacterial microbiota in two groups;Fig 3 Relative abundance of the most abundant genera of fecal bacterial microbiota in two groups

2.3 α多样性分析本研究对T组和H组样本测序所得数据进行均一化处理和α多样性分析(见图4)，Shannon指数分析显示，T组平均值为4.30，H组为4.40，秩和检验分析显示P值为0.8；Simpson指数分析显示T组平均值为0.86，H组为0.88，秩和检验分析显示P值为0.58；上述结果表明，战创伤状态下较健康人群的粪便相关细菌群落物种多样性和丰富度下降。

图4 两组粪便菌群α多样性分析(Shannon和Simpson指数)Fig 4 Fecal bacterial microbiota α diversity as calculated by Shannon and Simpson index in two groups

2.4 β多样性分析对T组和H组各样本粪便相关细菌群落的β多样性进行样品间物种多样性分析，其中PCoA分析显示，T组和H组可较明显划分为两大聚类，T组和H组各样本的粪便相关细菌群落结构差异有统计学意义(P<0.05)(见图5)，提示模拟战创伤患者早期肠道菌群结构较健康人即存在显著的变化。后续加权和未加权的MRPP分析显示P值分别为0.036和0.026(见表2)，进一步验证T组和H组粪便相关细菌群落的β多样性，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 两组间的加权和未加权的PCoA分析Fig 5 Weighted and unweighted PCoA of fecal bacterial microbiota in two groups

表2 T组和H组间的MRPP分析Tab 2 MRPP analysis between T group and H group

2.5 组间物种差异性分析本研究通过LEfSe方法确定了39个对T组贡献显著的不同水平的细菌物种，其中门水平2个，纲水平5个，目水平7个，科水平10个，属水平15个；按贡献度大小(LDA评分)依次为变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)、巨球菌属(Megasphaera)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactobacillales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、肠球菌科(Enterococcaceae)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、链球菌科(Streptococcaceae)、链球菌属(Streptococcus)、养分缺乏菌属(Abiotrophia)、气球菌科(Aerococcaceae)、弯曲菌目(Campylobacterales)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、变形杆菌属(Proteus)、乳酸杆菌属(Cloacibacillus)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、奇异菌属(Atopobium)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、麦卡氏菌属(Granulicatella)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、放线菌目(Actinomycetales)、魏斯氏菌属(Weissella)、乳球菌属(Lactococcus)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)(见图6)。本研究后续基于组间物种差异性分析确定了T组和H组间差异有统计学意义的20个菌属(P<0.05)(见图7)，按丰度高低依次为埃然，埃希氏菌属/志贺氏菌属(Escherichia/Shigella)、罗氏菌属(Roseburia)、梭菌属XIVa(ClostridiumXIVa)、布劳特氏菌属(Blautia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、巨球菌属(Megasphaera)、小杆菌属(Dialister)、Parasutterella、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、Anaerostipes、梭菌属IV(ClostridiumIV)、Butyricicoccus、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、乳酸杆菌属(Cloacibacillus)、罗氏菌属(Rothia)、乳球菌属(Lactococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)和奇异菌属(Atopobium)。

图6 基于LEfSe方法的显著特异性细菌物种筛选鉴定Fig 6 Association of specific bacteria taxa with different groups identified by LEfSe method

图7 T组和H组差异性菌属的秩和检验分析Fig 7 Kruskal-Wallis test for the significant different bacterial genera between T group and H group

3 讨论

严重战创伤后机体面临系统性或局部感染、菌血症、脓毒血症，甚至SIRS和多脏器功能障碍或衰竭等风险。肠道是人体最大的细菌库和内毒素库，严重战创伤后感染相关菌主要来自于肠道[7]，但严重创伤状态下的肠道菌群特征及肠道菌群失调在创伤后感染中的意义目前并不清楚[6]。因此，我们设计本研究，选择骨科收治的拟行手术治疗的大关节/骨盆骨折患者来模拟战创伤状态，同时纳入性别、年龄和BMI等相匹配的健康查体人员作为对照组，开展粪便细菌群落的16S rDNA高通量测序分析，明确创伤早期肠道菌群变化特征。

本研究以骨科收治准备手术的大关节或骨盆骨折患者模拟战创伤早期状态，白细胞、中性粒细胞、白介素-6、C反应蛋白等炎性指标较健康对照组升高，可较好地模拟创伤应激状态。我们尽量在患者术前和抗生素类药物使用前获得粪便样本，降低其他因素对肠道菌群的影响。通过物种注释分析发现，战创伤早期和健康人肠道内优势菌门主要分布在拟杆菌门、硬壁菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门中，这与目前肠道菌群研究结果一致[6，12，14]。基于OTUs的分析发现，战创伤早期和健康人肠道内大部分OTUs是共有的，但基于Shannon和Simpson指数的α多样性分析显示，战创伤早期较健康人群的粪便相关细菌群落的物种多样性和丰富度呈下降趋势，提示战创伤早期在出现严重感染之前即可出现肠道菌群的失调；同时，这也为后续在现有益生菌制剂补充和肠内营养等基础上，基于肠道微生态研发预测和干预战创伤后严重感染的方法提供了思路。后续基于PCoA和MRPP的β多样性分析提示战创伤早期肠道菌群结构即可与健康人有显著性差异。骨折患者腹胀、腹痛和便秘等胃肠道症状常见，肠道菌群失调发生率较高。骨折相关创伤对肠道菌群的影响，除了创伤应激本身对机体胃肠功能和肠道菌群的影响外，骨折患者活动受限、胃肠功能受到抑制也是导致肠道菌群失衡的因素。

本研究确定了对战创伤相关肠道菌群聚类贡献显著的39个细菌物种，包括变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、埃希氏菌属/志贺氏菌属等，主要集中在肠杆菌科和埃希氏菌属内，这也与早期通过培养等传统方法确定的创伤后感染相关菌的结果相对应。我们通过物种差异性分析筛选了20个战创伤显著相关的菌属，按丰度高低依次为埃希氏菌属/志贺氏菌属、罗氏菌属和梭菌属XIVa等，后续可利用上述确定的特异性菌属研发战创伤相关微生态预测方法。

本研究主要采用了细菌16S rDNA高通量测序的方法，无法有效筛选到种的水平，亦无法对菌群功能进行深入研究；后续需要开展分层研究，对战创伤严重程度和是否出现严重感染等进行分类，开展相关肠道菌群的宏基因组学分析，对菌群结构和功能进行深入挖掘，进一步明确战创伤显著相关菌群/菌种及其功能基因；通过肠道菌群研究手段筛查出可能会出现创伤后脓毒血症、SIRS和多器官功能障碍或衰竭的高危患者并开展微生态干预。此外，现代战争模式多样，战创伤种类繁多，大关节或骨盆骨折的创伤患者仅能代表其中一部分，后续有条件将深入纳入模拟胸腹部战创伤等状态，进一步评估相关状态下的肠道菌群结构和功能特征。

总体上，本研究提示战创伤早期即可出现肠道菌群失衡，未来通过扩大样本量，纳入不同类型战创伤患者，结合肠道菌群宏基因组等多组学分析，有望明确各种类型战创伤相关肠道菌群结构和功能特征，对于后续研发战创伤及感染相关的微生态预测和干预新方法，具有重要的临床和军事医学价值。