透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的机制研究

林木南，邵 翔，许丽梅，张 欣，朱在师，韩一旦，段辛威，陈建梅，高 松，李西海*

1中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州350025；

2福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性骨关节疾病，是生物力学、生物学、基因遗传等多种复杂因素共同作用的结果，其临床表现为关节疼痛、功能障碍，甚至关节畸形等，主要病理变化为软骨退变、骨赘形成、软骨下骨重塑异常等［1-2］。炎症反应是导致软骨退变的关键因素［3］，而Ras-Raf-丝裂原激活蛋白激酶的激酶（mitogenactivated proteinkinase kinase，MEK）-细胞外信号调节激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）信号通路在软骨基质降解的过程中发挥关键的调控作用［4-5］，也是防治OA的潜在有效靶点。微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）是一类非编码的小RNA分子，通过与信使RNA的直接结合，从而起到调控基因表达的作用，参与炎症反应的调控［6］。其中，miR-27b、miR-34a、miR-146a与OA发生发展密切相关，miR-27b可以靶向基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-13，影响软骨基质的降解［7］，miR-34a则与炎症因子介导的软骨细胞凋亡相关［8］，miR-146a可作为炎症信号通路的负反馈调节器，参与OA炎症反应中［9］，均已成为OA的生物标志物和治疗靶点研究的热点问题。

透骨消痛胶囊是福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂（批准文号：闽制字Z20100006），具有补肝肾、强筋骨、止痹痛之功，长期应用于临床，疗效可靠。本课题组前期研究显示，透骨消痛胶囊能够抑制OA的炎症反应，但具体作用机制有待深入研究［10］。因此，本研究以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导软骨细胞炎症反应为OA细胞模型，采用透骨消痛胶囊干预，观察Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路中关键调控因子表达及miR-27b、miR-34a、miR-146a的变化，旨在揭示透骨消痛胶囊抑制OA炎症反应的作用机制，为临床的应用推广提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

4周龄SPF级SD雄性大鼠20只，购于上海斯莱克实验动物公司［生产许可证号：SYXK（沪）2017-0005］，由福建中医药大学实验动物中心提供饲养环境及设施［许可证号：SYXK（闽）2019-0007］。本研究中处理实验动物方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 实验药物与试剂

透骨消痛胶囊组方：巴戟天12 g，白芍12 g，川芎6 g，肿节风6 g。参照前期透骨消痛胶囊提取方法［11］：14倍量超纯水回流提取药物2次，每次微沸后计时2 h，合并滤液后过滤，旋转蒸发浓缩，完全干燥后称取浸膏使用无菌PBS配制药物母液100 mg／mL，超声溶解后，无菌滤头过滤，4℃保存，备用，实验时根据需要进行稀释。

LPS（美国Sigma公司）；显影液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；MMP-3、MMP-13、p-ERK1／2、ERK1／2、MEK1／2、Raf、Ras抗体（美国Abcam公司）；羊抗兔、羊抗小鼠（武汉博士德生物公司）。

2 实验方法

2.1 软骨细胞提取与鉴定

采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法获得大鼠原代软骨细胞，即麻醉处死大鼠后，取双侧膝关节，手术刀片削取透明软骨层，Ⅱ型胶原酶消化处理，每隔2 h收集消化液，离心后即获得原代软骨细胞，进行培养。待细胞长至培养瓶85%时，进行传代。取第2代软骨细胞，爬片培养后，多聚甲醛固定、0.5%Txiton处理，根据免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）试剂说明进行操作，DAB显色液（北京中杉公司）显色，显微镜观察下记录结果。

2.2 软骨细胞分组和干预

取对数期生长的第2代软骨细胞分为4组，参照本课题组前期实验结果［11-12］，10 ng／mL LPS诱导建立软骨细胞炎症模型，透骨消痛胶囊最佳干预浓度为300μg／mL。具体干预方法如下：空白组用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培养8 h；模型组用含10 ng／mL LPS的10%FBS DMEM培养8 h；抑制剂组先用含10 ng／mL U0126的10%FBS DMEM干预30 min，再加入LPS培养8 h；透骨消痛胶囊组用含10 ng／mL LPS及300μg／mL透骨消痛胶囊的10%FBS DMEM同时培养8 h。

2.3 蛋白表达检测

各组干预结束后，收集蛋白样本，依据碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明进行定量，获取蛋白浓度，变性后，采用蛋白免疫印迹（Western blot）法对蛋白进行处理，显影曝光后获得条带，并选择β-actin作为内参，进行计算分析。每个指标获得3次有效数据后，进行统计分析。

2.4 基因表达检测

各组干预结束后，采用Trizol法提取总RNA，检测RNA浓度。再依据PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒进行逆转录，取2μL逆转录产物，根据ChamQ®SYBR®qPCR Master Mix说明，上机进行检测，选择GAPDH作为参照指标进行计算，其中引物序列见表1。

2.5 miRNAs表达检测

各组干预结束后，美国Taqman公司mirco-RNA提取试剂盒提取总miRNA，检测miRNA浓度后，依据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明进行反转录，取反转录后产物，qPCR法进行检测，分析计算所得数据。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

2.6 统计学方法

3 结 果

3.1 软骨细胞鉴定结果

Ⅱ型胶原组化阳性组细胞胞浆被染为棕黄色，细胞核呈蓝色，阴性对照组细胞胞浆未见明显棕黄色染色，仅有细胞核被染为蓝色，表明所获得的细胞为软骨细胞。见图1。

3.2 软骨细胞蛋白检测结果

图1 免疫组化鉴定（×400）Figure 1 Identification by using immunocytochemistry（×400）

软骨细胞中Ras、Raf、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表达比较，模型组比空白组明显升高（P＜0.01，P＜0.05），p-ERK1／2模型组比空白组表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，抑制剂组与透骨消痛胶囊组Ras、Raf、p-ERK1／2、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表达均明显下降（P＜0.01，P＜0.05），其中MEK1／2蛋白表达透骨消痛胶囊组比模型组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2和表2。

图2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路关键调控因子及MMPs蛋白表达比较Figure 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路关键调控因子及MMPs蛋白表达比较（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路关键调控因子及MMPs蛋白表达比较（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.3 软骨细胞基因检测结果

软骨细胞中MEK1／2、ERK1／2、MMP-3、MMP-13基因表达比较，模型组比空白组均明显升高（P＜0.01）；抑制剂组、透骨消痛胶囊组比模型组表达均降低（P＜0.01，P＜0.05）。见表3。

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表达比较（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表达比较（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.4 软骨细胞mi RNAs检测结果

软骨细胞中miR-27b的表达，模型组低于空白组（P＜0.01），抑制剂组、透骨消痛胶囊组均高于模型组（P＜0.01）；miR-34a、miR-146a的表达，模型组均高于空白组（P＜0.01，P＜0.05），抑制剂组、透骨消痛胶囊组均低于模型组（P＜0.01，P＜0.05）。见表4。

表4 miRNAs表达比较（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

表4 miRNAs表达比较（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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4 讨 论

OA属于中医学“痹证”“痿证”范畴，病位在肝肾，病在筋骨，以肝肾亏虚、筋骨失养致痿为本，以腠理空虚复感风寒湿邪致痹为标［13］。透骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎、肿节风组成，方中巴戟天辛温，补肾强筋，祛风除湿以治本为君药；白芍苦酸，养血柔肝止痛为臣药；川芎辛温，活血行气，祛风止痛，肿节风祛风通络，活血止痛，二者均为佐使药。四药共奏补肝肾、强筋骨、止痹痛之功效，长期应用于临床疗效可靠。

Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的一部分［14］。当炎症因素刺激细胞后，炎症因子与细胞膜上的受体特异性结合，从而激活MAPK信号下游的Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路，即经信号传递后，Ras由失活状态转为活化，并进一步活化在胞膜上的Raf，Raf被激活后与信号通路中的“枢纽”MEK结合，从而激活MEK，活化的MEK则与ERK直接联接，激活ERK，使其由胞浆进入胞核，激活转录因子，以此参与调控软骨细胞增殖、凋亡及炎症等生物过程，引起OA软骨退变等病理改变［15-16］。故Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路是治疗OA的一个潜在途径。LPS则可以通过一系列的级联反应激活相关炎症信号通路，刺激多个炎症因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1等表达，多用于炎症反应的体外研究。本课题组前期实验结果亦表明，10 ng／mL LPS干预8 h可明显刺激TNFα、IL-1β的表达，诱导软骨细胞炎症反应［12］。故本研究中选择LPS作为诱导剂，建立大鼠软骨细胞体外炎症模型进行研究。

MMPs是参与细胞外基质变性降解和OA发病的主要蛋白酶。MMPs家族成员众多，不同的MMPs可作用于不同的软骨基质导致其降解［17］。MMP-13是引起OA软骨退变的众多MMPs中最为关键的酶，在软骨基质的降解中起主导作用，在优先消化Ⅱ型胶原的同时，还能够降解蛋白多糖，加速破坏软骨基质。MMP-3在降解多种胶原和蛋白多糖的同时，激活其他的MMPs，介导结缔组织的重塑。一般情况下MMPs的正常作用可以维持软骨基质的合成与降解平衡，而炎症因子会导致MMPs过度表达，软骨基质降解过度，最终导致软骨病变。

本研究结果显示，经LPS刺激后模型组中Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路的关键调控因子及MMP-3、MMP-13表达均明显增多，表明LPS诱导软骨细胞炎症反应模型成功建立。透骨消痛胶囊干预 后 则 明 显 降 低Ras、Raf、MEK1／2、ERK1／2的 表达，其趋势同抑制剂组一致，表明透骨消痛胶囊可调控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路中关键因子的表达；同时透骨消痛胶囊干预后MMP-3、MMP-13的表达亦减少，表明透骨消痛胶囊可抑制炎症反应介导的软骨基质降解。

在OA中，miRNAs参与调控炎症因子及MMPs的表达，对软骨基质的合成、降解有关键的调控作用［18］。在使用IL-1β诱导软骨细胞后，miR-27b的表达明显降低，并促进Col2a1、抑制MMP-13的表达，从而影响软骨基质的降解，且MMP-13是miR-27b的靶基因之一［7］。miR-34a则与炎症因子介导的软骨细胞凋亡相关，在OA患者软骨中的表达增多［8］。IL-1β作为诱导剂刺激软骨细胞后，miR-34a表达明显增高，并引起细胞死亡和衰老。miR-34a还可以降低Col2a1基因的表达，影响Ⅱ型胶原表达，破坏软骨的合成［19］。miR-146a则刺激多种炎症因子的表达，并受炎症因子的影响。软骨细胞系ATDC5经LPS刺激后，炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达和产物增加，miR-146a表达亦明显上升，并且过表达miR-146a后加重了LPS诱导的炎症损伤［9］。另有研究表明［20］，miR-146a通过靶向TNF受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）和IL-1受体相关激酶1（interleukin receptor-1 associated kinase-1，IRAK1）作为促炎信号通路的负反馈调节器，参与到OA炎症反应中。

本研究结果显示，与空白组相比，模型组中miR-27b表达明显降低，miR-146a、miR-34a表达明显升高，而透骨消痛胶囊干预后，miR-27b表达上升，miR-146a、miR-34a的表达下降，说明透骨消痛胶囊可以调控上述miRNAs的表达，通过调控mRNA的起始调控因子，抑制OA炎症反应及软骨基质的降解。

综上，透骨消痛胶囊通过调控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信号通路中关键调控因子及miR-27b、miR-146a、miR-34a的表达，调节软骨细胞炎症反应，从而抑制骨关节炎炎症及软骨基质的降解，保护关节软骨。但由于OA的发病机制尚未完全明确，且中药成分复杂具有多靶点的特性，其机制仍需进一步深入研究证实。