川芎嗪对成纤维细胞增殖及TGF-β1和bFGF表达的影响

王楠 许良 吴国明

[摘要]目的：研究川芎嗪对体外培养大鼠成纤维细胞增殖及碱性成纤维细胞因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）表达的影响，从而探讨川芎嗪抑制瘢痕形成的作用机制。方法：体外分离培养大鼠皮肤成纤维细胞，采取MTT法及荧光染色检测不同浓度的川芎嗪对大鼠成纤维细胞增殖能力的影响，ELISA法测定大鼠皮肤瘢痕成纤维细胞TGF-β1和bFGF的表达量。结果：在三种川芎嗪浓度条件下（1mg/ml，10mg/ml，50mg/ml），大鼠皮肤成纤维细胞增殖能力有不同程度的抑制作用，抑制作用与川芎嗪浓度成正比，在50mg/ml浓度时，抑制作用最为明显。采用ELISA法测定培养上清TGF-β1和bFGF的分泌量，发现实验组两者含量均明显低于对照组，其中浓度为50mg/ml时，含量最低（P<0.05）。结论：川芎嗪能够明显抑制体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖能力，降低TGF-β1和bFGF的表达量，从而在一定程度上抑制大鼠皮肤成纤维细胞的活性。

[关键词]川芎嗪;皮肤;成纤维细胞;瘢痕;转化生长因子β1;碱性成纤维细胞因子

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）05-0056-03

Effect of Ligustrazine on Fibroblast Proliferation and the Expression of TGF-β1 and bFGF in Fibroblasts

WANG Nan，XU Liang，WU Guo-ming

（Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medical University，Hangzhou 311201，Zhejiang，China）

Abstract： Objective  To investigate the influence of ligustrazine on the proliferation and expresson of TGF-β1 and bFGF for human normal and hypertrophic scar dermal fibroblasts cultured in vitro and to explore the relevant mechanism. Methods  The rat skin fibroblasts were isolated and cultured in vitro， and MMT assay was used to detect the effects of ligustrazine at various concentrations on the rat skin scar fibroblasts in vitro. ELISA was carried out to determine the contents of TGFβ1 and bFGF in rat skin scar fibroblasts. Results  Under 3 ligustrazine concentrations （1mg/ml， 10mg/ml， 50mg/ml）， the rat skin fibroblasts were suppressed to various degrees， and such suppression was positively correlated with concentration. Typically， the most obvious suppression was attained at the concentration of 50mg/ml. Besides， TGF-β1 and bFGF contents were measured by ELISA， the results suggested that， the expression contents in experiment group were lower than those in control group， and the lowest contents were detected at the concentration of 50mg/ml （P<0.05）. Conclusion  Ligustrazine markedly suppresses the activity of rat skin fibroblasts cultured in vitro， and reduces the TGF-β1 and bFGF contents. Typically， the efficacy peaks under a relatively suitable concentration， thus partially suppressing the activity of rat fibroblasts.

Key words： ligustrazine; skin; fibroblasts; scar; transforming growth factor-β1（TGF-β1）; basic fibroblast growth factor（bFGF）

外傷所致皮肤损伤（尤其深度烧伤）愈合后形成增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）的现象极为常见[1]。瘢痕不但影响美观，严重时还可导致局部畸形或功能障碍，从而给患者后期治疗造成沉重的经济和心理负担[2]。病理性瘢痕作为皮肤损伤最常见的并发症之一，一直是外科修复领域亟待解决的难题;抑制皮肤增生性瘢痕的生长及纤维化病变的进展，是近年研究的焦点[3]。尽管临床治疗瘢痕的方法众多（如手术治疗、放射治疗、药物治疗等），但疗效都并不尽如人意[4]。川芎嗪是临床上广泛使用的一种心脑血管药物，具有改善血液流变学和清除氧自由基的作用[5]。研究发现，川芎嗪有抑制皮肤增生性瘢痕生长的药理作用，且临床上已将其用于预防烧伤后瘢痕的形成[6]。中药及中药制剂治疗，不仅能开拓临床诊疗思路，更能有效防治局部瘢痕生长，且能合理降低医疗费用，尤其对烧伤后瘢痕的愈合有着十分显著的效果[7]。本研究从细胞水平入手，旨在观察川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞中TGF-β1和bFGF的影响，从而探讨川芎嗪对抑制瘢痕形成的影响，为期增生性瘢痕预防药物的临床应用及开发提供实验基础和依据。

1  材料和方法

1.1 材料：新生大鼠皮肤成纤维细胞（上海复蒙基因生物科技有限公司）;DMEM培养液、胎牛血清（Gibco公司）;四甲基偶氮唑盐（MTT，Amresco公司）;二甲基亚砜（DMSO，Amresco公司）;TGF-β1和bFGF的ELISA检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），Vimentin兔多克隆抗体及FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）（北京碧云天生物技术有限公司），恒温水浴槽（DK-600型，上海医疗器械五厂），台式离心机（800型，上海手术器械厂），全自动酶标仪（ELX800型，Bio-Tek公司）等。

1.2 方法

1.2.1 MTT检测川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞增殖能力的影响：精确称量不同浓度的川芎嗪后加入定量的DMEM培养液。按浓度分为四组：对照组（0mg/ml）;1mg/ml组;10mg/ml组;50mg/ml组。每组6孔。先每孔加入l×l04个细胞，37℃、5% C02孵育12h，细胞贴壁后，弃掉培养液，对照组每孔加入无血清DMEM培养液600μl，其余各组每孔加入对应浓度川芎嗪液600μl。培养48h后，每孔各加5mg/ml的MTT溶液40μl，培养4h，弃上清液，加入300μl DMSO，振荡15min，用酶标仪测490nm波长处各孔的吸光度（OD值）。

1.2.2 免疫荧光检测川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞增殖能力的影响：细胞处理方法同1.2.1，每组3个重复，不同浓度川芎嗪处理48h后，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，5%BSA封闭30min，然后兔抗Vimtin多克隆抗体（1：200）4℃孵育过夜，PBS清洗3遍，FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1：500）室温孵育1h，激光共聚焦显微镜拍照。

1.2.3 川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞TGF-β1和bFGF表达的影响：采用ELISA法测定各组细胞培养上清液中TGF-β1和bFGF含量，按浓度分为四组，对照组（0mg/ml）;1mg/ml组;10mg/ml组;50mg/ml组，每组6孔重复，具体药物处理方法同上。处理结束后收集培养上清，4℃ 1 200rpm离心5min去掉细胞碎片，余下的液体进行ELISA检测，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。操作结束后用酶标仪在450nm处测定样品OD值，根据样品吸光度值计算样品浓度。

1.3 统计学分析：采用SPSS 19.0软件分析，数据以均数±标准差（x?±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05则视为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞活性的作用：在不同浓度的川芎嗪作用下，免疫荧光检测Vimentin阳性细胞数，发现随着川芎嗪浓度的升高，阳性细胞数明显减少（图1A～D），MTT检测盒检测细胞活力，吸光度（OD）值逐渐下降。50mg/ml组对细胞增殖活性的抑制作用最明显。川芎嗪浓度为1mg/ml，10mg/ml，50mg/ml时，根据吸光度（OD）值，计算各组的细胞活力分别为76.2±11.3，63.4±7.8，57.3±8.8，均低于对照组100.0±10.3，差异有统计学意义（P<0.05）。在川芎嗪浓度为50mg/ml时，差异最为明显，对细胞活力的抑制作用最强（P<0.01）。

2.2 川芎嗪对大鼠皮肤成纤维细胞中TGF-β1和bFGF表达的影响：在体外川芎嗪作用下，大鼠皮肤成纖维细胞中TGF-β1和bFGF的表达呈现不同程度的抑制作用，抑制作用与川芎嗪浓度成正比。50mg/ml组抑制作用最强，差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

bFGF对血管内皮细胞有很强促进作用，可刺激成纤维细胞及皮肤平滑肌细胞的生长和增殖，诱导血管新生，从而促进胶原纤维及弹力纤维合成。研究表明，bFGF可在创面愈合初期使成纤维胞的数量明显增加[8]，不仅能显著促进白细胞与单核细胞等炎性细胞吞噬细菌，而且能够有效改善局部的组织环境使其有利于伤口的全面修复[9]。

TGF-β1作为启动和终止组织修复的重要细胞因子，参与了创面愈合过程中上皮再生、间质增生、成纤维细胞纤维化、胶原生成及血管形成等过程。研究表明，TGF-β1对炎症细胞有趋化作用，能促进成纤维细胞形成[10]，TGF-β1受抑制后可减缓成纤维细胞增生，进而预防增生性瘢痕形成。TGF-β1与成纤维细胞的增殖、分化、迁徙、凋亡及胶原代谢等多种生理、病理过程密切相关[11]。

皮肤成纤维细胞作为创面愈合过程中的主要效用细胞，常表现为过度增殖和功能活跃，并能引起一系列反应，造成创面修复失控，导致细胞外间质的过多沉积和创伤的过度愈合，最终形成病理性瘢痕[12]。可见，皮肤成纤维细胞的功能异常及过度增殖在病理性瘢痕的增生中扮演着重要的角色。在药物防治皮肤增生性瘢痕生长的攻坚战中，中药及中药提取物因为其显著的效果而广受关注[13-14]。赵治伟等[15]通过研究川芎嗪注射液及丹红注射液与可吸收生物膜联合应用预防组织粘连的有效性，证实三者的联合应用对于预防疏松结缔组织粘连的效果明显优于单独应用吸收生物膜。雷水生等[16]通过实验发现川芎嗪能改变增生性瘢痕成纤维细胞形态和抑制其增殖，但并不影响其活力。研究证实，川芎嗪为一种新型钙离子拮抗药，可通过直接清除氧自由基、抗脂质过氧化、抑制成纤维细胞分裂和增殖，从而起到抗组织损伤和防治肺纤维化的作用，通过抑制肝脂质过氧化、抑制星状细胞活化增殖、降低胶原合成等途径改善肝功能，因此川芎嗪有抑制皮肤增生性瘢痕生长的药理作用。

本研究结果显示，采用MTT法检测，与对照组相比，实验组细胞增殖延迟，生长活力下降，当浓度为50mg/ml时，增殖活力抑制最为明显，具有剂量依赖性，说明川芎嗪对于成纤维细胞的增殖有显著的抑制作用。采用ELISA试剂法测定各组标本TGF-β1和bFGF表达含量。发现在三种川芎嗪浓度条件下，和对照组相比，TGF-β1和bFGF表达含量均有不同程度的下降，并且下降程度与浓度成正比，作用效果具有浓度依赖性，当浓度为50mg/ml时，抑制作用作为明显。表明川芎嗪可在一定程度上抑制皮肤成纤维细胞中TGF-β1和bFGF的表达水平，从而减少皮肤成纤维细胞向瘢痕组织的转化，避免大量瘢痕组织增生，对人体瘢痕的形成起到一定的抑制作用，其作用和功效值得进一步研究。

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[收稿日期]2020-05-08

本文引用格式：王楠，许良，吴国明.川芎嗪对成纤维细胞增殖及TGF-β1和bFGF表达的影响[J].中国美容医学，2021，30（5）：56-58.