维生素甲酸在中长波紫外线诱导小鼠皮肤光老化模型中的作用

李敏 赵飞

(河南省人民医院药学部，河南 郑州 450003)

长期紫外线照射会引发人皮肤组织光老化，出现皮肤增厚、粗糙、色素沉积、皮革样外观等症状〔1〕；皮肤胶原纤维含量减少、变性是光老化的特征性组织学表现〔2〕。维生素甲酸是目前皮肤光老化治疗的主要药物，可通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)分泌来改善患者临床症状〔3〕。研究发现，维生素甲酸类药物在体内通过与维生素甲酸受体、维生素甲酸X受体特异性结合而发挥药理学作用〔4〕。但维生素甲酸抑制光老化皮肤MMPs分泌是否与维生素甲酸受体机制有关仍未明确。本研究旨在探讨维生素甲酸抑制皮肤光老化的相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性ICR小鼠90只，体重22～26 g，购于北京隆安实验动物养殖中心，批号：SCXK(京)2014-0003。饲养温度22～24℃、湿度50%～60%，12 h节律光照，自由饮食、进食。

1.2主要试剂 反式维生素甲酸、维生素甲酸受体拮抗剂、维生素甲酸受体激动剂、维生素甲酸X受体拮抗剂、维生素甲酸X受体激动剂均购于上海仁捷生物科技有限公司；兔抗人MMP3多克隆抗体、兔抗人MMP13多克隆抗体购于北京奥维亚生物有限公司。

1.3皮肤光老化模型建立 随机将90只小鼠分为模型80只，正常对照10只进行适应性喂养。模型组第2周起开始进行长波紫外线(UVA)、短波紫外线(UVB)联合照射，照射距离30 cm，每周照射3次，隔日进行；照射时间在第2、3、4周分别为30 min/次、45 min/次、60 min/次，第5周以后为90 min/次，共照射12 w，每次照射前剔去小鼠背部毛发。正常对照组常规喂养12 w。

1.4分组与处理 将造模的80只小鼠随机分为：模型组、维生素甲酸组、维生素甲酸受体拮抗剂组(维生素甲酸+维生素甲酸受体拮抗剂)、维生素甲酸X受体拮抗剂组(维生素甲酸+维生素甲酸X受体拮抗剂)、维生素甲酸受体激动剂组、维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组、维生素甲酸X受体激动剂组、维生素甲酸X受体激动剂联合拮抗剂组，每组10只。其中维生素甲酸的给药剂量为2 mg/kg；维生素甲酸受体拮抗剂、维生素甲酸X受体拮抗剂的给药剂量为4 mmol/kg；激动剂的给药剂量为1.6 mmol/kg；溶剂为乙醇∶丙二醇(7∶3)，连续给药8 w，每周给药5次，在小鼠背部中央皮肤上外用100 μl，给药后避光；模型组仅给予乙醇丙二醇溶剂。

1.5标本采集与制备 末次给药后，在全麻状态下取小鼠背部皮肤，分为2份，其中一份液氮速冻后-80℃保存，另一份多聚甲醛固定后常规行苏木素-伊红(HE)染色。

1.6Western印迹检测 取部分冻存的皮肤组织标本，RIPA提取总蛋白，定量后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别滴加兔抗人MMP3多克隆抗体(1∶500稀释)、兔抗人MMP13多克隆抗体(1∶500稀释)，4℃过夜，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)，室温下静置2 h，电化学发光(ECL)显色，避光显影，分析各条带灰度值，以GAPDH为内参对照。

1.7标本组织中胶原蛋白含量检测 取小鼠皮肤组织30 mg，碱水解-光度法测定羟脯氨酸含量，操作严格按试剂盒说明进行。胶原蛋白含量=羟脯氨酸含量×7.46。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组皮肤组织病理学改变情况 正常对照组小鼠表皮结构完整，厚度正常。模型组小鼠皮肤增厚，表皮不规则，胶原束断裂、卷曲、排列不均。维生素甲酸组、维生素甲酸X受体拮抗剂组、维生素甲酸受体激动剂组与模型组相比表皮厚度和真皮胶原纤维明显改善，以真皮上部改善最明显。维生素甲酸受体拮抗剂组、维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组、维生素甲酸X受体激动剂组、维生素甲酸X受体激动剂联合拮抗剂组与模型组相比无明显改善。见图1。

图1 各组皮肤组织病理学改变(HE，×200)

2.2维生素甲酸通过维生素甲酸受体对光老化皮肤MMP3和MMP13表达的影响 模型组MMP3、MMP13蛋白表达水平明显高于正常对照组(P<0.01)，维生素甲酸组明显低于模型组(P<0.05)，维生素甲酸受体拮抗剂组明显高于维生素甲酸组(P<0.05)；维生素甲酸X受体拮抗剂组与维生素甲酸组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表1。

1～5：正常对照组、模型组、维生素甲酸组、维生素甲酸受体拮抗剂组、维生素甲酸X受体拮抗剂组图2 各组MMP3和MMP13蛋白表达Western印迹电泳

表1 各组MMP3和MMP13蛋白相对表达量比较

2.3维生素甲酸受体激动剂对光老化皮肤MMP3和MMP13表达的影响 维生素甲酸受体激动剂组MMP3、MMP13蛋白表达水平明显低于模型组，维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组明显高于维生素甲酸受体激动剂组(P<0.05)。见图3，表2。

1～4:正常对照组、模型组、维生素甲酸受体激动剂组、维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组图3 各组MMP3和MMP13 Western印迹电泳

表2 各组MMP3和MMP13蛋白相对表达量比较

2.4维生素甲酸X受体激动剂对光老化皮肤MMP3和MMP13表达的影响 维生素甲酸X受体激动剂组MMP3、MMP13蛋白表达水平与模型组差异无统计学意义(P>0.05)；维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组与维生素甲酸受体激动剂组差异无统计学意义(P>0.05)。见图4，表3。

1～4：正常对照组、模型组、维生素甲酸X受体激动剂组、维生素甲酸X受体激动剂联合拮抗剂组图4 各组MMP3和MMP13的Western blot电泳图

表3 各组MMP3和MMP13蛋白相对表达量比较

2.5各组小鼠皮肤组织中胶原蛋白含量比较 正常对照组、模型组、维生素甲酸组、维生素甲酸受体拮抗剂组、维生素甲酸X受体拮抗剂组、维生素甲酸受体激动剂组、维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组、维生素甲酸X受体激动剂组、维生素甲酸X受体激动剂联合拮抗剂组胶原蛋白含量依次为：(20.82±2.16)、(13.95±2.41)、(17.73±1.85)、(13.50±1.76)、(17.47±1.90)、(15.93±2.11)、(13.19±1.61)、(12.82±1.66)、(12.76±1.86)μg/mg。维生素甲酸受体拮抗剂组、维生素甲酸受体激动剂联合拮抗剂组明显低于维生素甲酸组、维生素甲酸受体激动剂组(P<0.05)。维生素甲酸X受体激动剂组与维生素甲酸组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

真皮胶原纤维变性、含量减少是皮肤光老化的主要病理学表现〔5〕。紫外线反复照射可抑制前胶原蛋白合成，加速降解胶原蛋白，胶原蛋白含量减少引发真皮层中的胶原纤维出现病理性改变〔6〕。MMPs作为具有生物活性的胞外基质降解酶，参与皮肤光老化的发生与发展〔7〕。相关研究显示，人体皮肤长时间暴露于紫外线下会提升MMP1、MMP3表达水平，MMP1能够促进Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白裂解〔8〕，同时MMP3也具有明显的胶原蛋白降解活性〔9〕。基础研究结果显示，MPP13可增强Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原裂解活性〔10〕。

维生素甲酸能够抑制光老化皮肤组织中的MMPs表达，降低胶原纤维降解率，缓解光老化皮肤的发生与发展〔11〕。维生素甲酸类药物在体内主要通过与维生素甲酸受体、维生素甲酸X受体相互结合，进而发挥药理学作用。但维生素甲酸受体在维生素甲酸抑制皮肤光老化MMPs表达中的作用鲜有报道。本研究显示，维生素甲酸能够明显抑制小鼠光老化皮肤组织中MMP3、MMP13表达水平，抑制胶原降解，提升皮肤中胶原蛋白含量，改善皮肤组织学表现；维生素甲酸受体拮抗剂可逆转维生素甲酸对小鼠光老化皮肤MMP3、MMP13表达的抑制作用，加速胶原降解，皮肤中胶原含量明显低于维生素甲酸组，而维生素甲酸X受体拮抗剂无上述作用。提示维生素甲酸可通过维生素甲酸受体降低皮肤组织中MMP3、MMP13蛋白表达，抑制光老化皮肤的胶原降解。

为进一步验证上述推测，本研究使用维生素甲酸受体、维生素甲酸X受体激动剂、拮抗剂进行干预，结果显示，维生素甲酸受体激动剂可明显下调光老化皮肤组织中的MMP3、MMP13表达水平，与维生素甲酸具有类似作用，但维生素甲酸X受体激动剂无上述作用。与此同时，维生素甲酸受体拮抗剂可抑制激动剂的改善作用。提示维生素甲酸受体参与维生素甲酸类药物发挥药效学作用，但维生素甲酸X受体未见明显作用。本实验发现了维生素甲酸可通过维生素甲酸受体抑制光老化皮肤组织中MMP3、MMP13蛋白表达，但维生素甲酸受体包含α、β、γ3种亚型〔12〕，具体涉及哪种亚型仍需进一步研究。