miR-203a-3p靶向JDP2基因调控结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

王一祺 修文超 徐明

(山东大学齐鲁医院(青岛)肛肠科，山东 青岛 266002)

结肠癌是发病率和死亡率均较高的常见恶性肿瘤，其发生发展过程受多基因、多阶段的复杂调控，所以从分子层面精准靶向医疗可有效提高结肠癌的疗效，对其预防和早期诊断也具有重要意义〔1〕。miRNA是一类非编码小分子单链RNA，研究发现多种miRNA在结肠癌患者中表达失衡，参与癌症的发生和进展过程，是结肠癌早期诊断、预后预测的潜在分子生物学标志物和治疗靶点〔2〕。miR-203a-3p通过抑制鼻咽癌中的LIM和SH3结构域蛋白(LASP)1抑制细胞增殖和转移〔3〕；miR-203a-3p可通过下调靶基因蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)5的表达抑制胃癌细胞增殖〔4〕；lncRNA HOTAIR通过上调miR-203a-3p的表达水平和Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路的活性来抑制结肠癌增殖，降低化学耐药性〔5〕。Jun二聚化蛋白(JDP)2是一种参与组蛋白乙酰化的转录因子，其通过改变染色质结构调控基因转录进而在细胞的生理或病理活动中发挥功能作用〔6〕。研究发现JDP2是一种新的抑癌因子，通过多种途径抑制恶性肿瘤的早期侵袭和转移，JDP2可通过不同通路抑制人胰腺癌上皮向间质转化〔7〕。但miR-203a-3p调控JDP2基因对结肠癌细胞生物学行为的影响还未有报道，本研究探讨miR-203a-3p调控JDP2对结肠癌细胞的生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌细胞SW480、SW620、LOVO、HT29和人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460购自中国科学院上海细胞库；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、噻唑蓝(MTT)试剂盒购自Sigma公司；Matrigel胶、Transwell小室购于美国BD公司；放射免疫沉淀测定(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗兔IgG二抗、兔源β-actin、JDP2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、周期蛋白依赖性激酶(CDK)1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9多克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2细胞培养 SW480、SW620、LOVO、HT29和NCM460细胞均采用Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养液(含10%胎牛血清)孵育，培养箱设置为37 ℃、含5% CO2、饱和湿度。

1.3转染与分组 将80%融合的对数期HT29细胞(接种96孔板)用无血清RPMI1640同步化12 h，随后按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染。根据转染序列片段和质粒的不同分为miR-203a-3p组、miR-con组(转染miR-con)、anti-miR-203a-3p组、anti-miR-con组、pcDNA组、pcDNA-JDP2组、anti-miR-203a-3p+si-con组、anti-miR-203a-3p+si-JDP2组。

1.4qRT-PCR检测miR-203a-3p和JDP2 mRNA表达水平 Trizol试剂提取总RNA，检测RNA纯度和浓度合格后，按照反转录试剂盒合成cDNA，以β-actin为内参按照荧光定量试剂盒使用说明进行qRT-PCR。采用2-△△Ct法计算miR-203a-3p和JDP2 mRNA相对表达量。

1.5Western印迹检测蛋白的表达 在RIPA裂解液中裂解各组HT29细胞，蛋白定量后每组取50 μg蛋白样品上样进行SDS-PAGE，利用湿法转膜装置并转膜，设置电流为300 mA、时间30 min。5%脱脂奶粉封闭膜后。在4℃下加入1∶1 000稀释一抗孵育膜过夜；室温条件下加入1∶2 000稀释二抗孵育2 h。随后进行暗室显影、定影。Quantity One软件用于检测蛋白条带灰度值，JDP2、CyclinD1、CDK1、MMP-2、MMP-9蛋白与β-actin的灰度值之比即目的蛋白表达水平。

1.6MTT检测细胞增殖 在96孔板培养24 h、48 h、72 h的每孔HT29细胞中补充20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后用二甲基亚砜(DMSO)溶解晶体，酶标仪测定吸光度(A)值，波长为490 nm。实验组与空白对照组的A值百分比计算细胞活性(%)。

1.7Transwell检测细胞迁移和侵袭 调整各组HT29细胞浓度为2×104个/ml无血清RPMI1640。取4×103个细胞加入Transwell上室(侵袭实验时包被基质胶，迁移实验时未包被)。取500 μl完全培养基加入下室。培养24 h后，用4%多聚甲醛固定穿膜HT29细胞，30 min后用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下观察、统计，以随机选取5个视野的平均值表示侵袭或迁移细胞数。

1.8荧光素酶报告基因检测实验检测 miR-203a-3p 对JDP2的靶向调控构建含miR-203a-3p结合位点的JDP2野生型(WT)或突变型(MUT)3′UTR-荧光素酶表达载体(JDP2-WT和JDP2-MUT)，用LipofectamineTM2000将JDP2-WT和JDP2-MUT分别与miR-con、miR-203a-3p共转染。荧光素酶报告基因检测仪测定转染48 h各组HT29细胞荧光素酶活性和Renilla活性，实验结果以二者的比值表示。

1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-203a-3p和JDP2在人正常结肠黏膜上皮细胞株与结肠癌细胞中的表达 SW480、SW620、LOVO、HT29细胞中miR-203a-3p的表达较NCM460细胞显著增加，JDP2 mRNA和JDP2蛋白表达较NCM460细胞显著减少(均P<0.05)。见表1和图1。结肠癌细胞中miR-203a-3p高表达，JDP2低表达；选择表达差异最显著的HT29细胞用于后续实验。

表1 miR-203a-3p和JDP2在NCM460、SW480、SW620、LOVO、HT29细胞中的表达

图1 各组JDP2蛋白表达

2.2干扰miR-203a-3p对HT29细胞增殖影响 与anti-miR-con组相比，anti-miR-203a-3p组HT29细胞中miR-203a-3p的表达水平、细胞活性、CDK1和CyclinD1蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)。见图2和表2。

图2 检测HT29细胞中CDK1和CyclinD1的表达

表2 干扰miR-203a-3p表达对HT29细胞增殖的影响

2.3干扰miR-203a-3p对HT29细胞迁移侵袭和迁移相关蛋白表达的影响 anti-miR-203a-3p组HT29细胞的迁移及侵袭数量较anti-miR-con组显著降低约65.02%和63.35%(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平较anti-miR-con组显著降低(P<0.05)。见表3、图3、4。

表3 干扰 miR-203a-3p对HT29细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达的影响

图3 两组HT29细胞迁移和侵袭(结晶紫染色，×200)

1～2：anti miR-con组，anti-miR-203a-3p组图4 两组MMP-2和MMP-9的表达

2.4miR-203a-3p对JDP2的靶向作用软件TargetScan对miR-203a-3p与JDP2之间的靶向结合预测结果 见图5。结肠癌HT29细胞的荧光素酶活性在miR-203a-3p组与JDP2-WT载体共转染后显著低于miR-con组(P<0.05)；而其在miR-203a-3p组与JDP2-MUT载体共转染后无明显变化(P>0.05)，见表4。miR-203a-3p组结肠癌HT29细胞中JDP2的表达水平(0.11±0.02)较miR-con组(0.24±0.06)显著降低；anti-miR-203a-3p组结肠癌HT29细胞中JDP2的表达水平(0.63±0.05)较anti-miR-con组(0.26±0.04)显著升高(P<0.05)，见图6。

图5 JDP2的3'UTR中含有与miR-203a-3p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-con组,miR-203a-3p组,anti-miR-con组,anti-miR-203a-3p组图6 结肠癌HT29细胞中JDP2的表达

2.5过表达JDP2抑制HT29细胞增殖、迁移和侵袭 与pcDNA组相比，pcDNA-JDP2组HT29细胞活性、细胞迁移和侵袭数量均显著降低(均P<0.05)，JDP2的表达水平显著升高(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，见图7、表5。

2.6沉默JDP2表达部分逆转干扰miR-203a-3p对HT29细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 与anti-miR-203a-3p+si-con组相比，anti-miR-203a-3p+si-JDP2组HT29细胞活性显著增加(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数量显著升高(P<0.05)，JDP2的表达水平显著降低(P<0.05)，CDK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。见表6、7，图8。

1～2：pcDNA组,pcDNA-JDP2组图7 各组HT29细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白表达

表5 过表达JDP2表达对HT29细胞增殖、迁移和侵袭及HT29细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白的作用

表6 anti-miR-203a-3p和JDP2表达对HT29细胞增殖、迁移和侵袭的作用

表7 anti-miR-203a-3p和JDP2表达对HT29细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白的作用

1～4：anti-miR-con组,anti-miR-203a-3p组,anti-miR-203a-3p+si-con组,anti-miR-203a-3p+si-JDP2组图8 各组检测HT29细胞增殖相关蛋白和迁移相关蛋白

3 讨 论

上皮-间质转化(EMT)在肿瘤的原位浸润和远处转移扮演重要角色〔8〕，越来越多的研究发现miRNA可参与调控EMT的过程，进而影响肿瘤的侵袭及转移〔9〕。研究发现miR-203a通过负向靶向同源异形盒基因家族成员(HOX)D3和抑制通过血管内皮生长因子受体(VEGFR)途径的细胞信号传导来抑制肝细胞癌细胞侵袭、转移和血管生成〔10〕；肝细胞外泌体miR-203a-3p可诱导结肠癌细胞间充质-上皮细胞转化〔11〕。过表达miR-203可降低结肠癌细胞的侵袭及迁移能力〔12〕；此外，miR-203可能通过调控磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基(P110α)、蛋白激酶B(AKT)1、细胞外调节蛋白激酶(ERK)2基因的表达调节结肠癌癌细胞增殖和转移〔13〕。与邻近的正常组织相比，miR-203a-3p在结肠癌组织中上调表达，通过靶向磷酸二酯酶(PDE)4D促进结肠癌的增殖和迁移〔14〕。本研究提示miR-203a-3p在结肠癌细胞中表达水平显著升高，干扰miR-203a-3p表达可降低HT29细胞增殖、迁移和侵袭能力；下调CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平且miR-203a-3p可靶向调控JDP2的表达。

JDP2是转录因子的活化蛋白(AP)-1家族的成员，也是AP-1的抑制剂；JDP2过表达抑制AP-1信号传导保护心肌细胞免于肥大和凋亡诱导〔15〕；JDP2缺乏会促进心脏肥大和对压力超负荷的功能障碍〔16〕。JDP2的高表达与肝癌患者的生存率相关，可作为肝癌的肿瘤抑制剂〔17〕；miR-501通过靶向JDP2促进肝细胞癌的EMT〔18〕。而JDP2过表达可引起小鼠心脏功能障碍〔19〕；JDP2通过p16Ink4a-pRb和Arf-p53途径控制缺氧诱导的复制衰老〔20〕。而且JDP2还能促进神经母细胞瘤细胞的分化，此过程中CyclinD1表达水平降低〔21〕。本研究提示JDP2在结肠癌细胞中的水平减少，过表达JDP2可下调CDK4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达，并降低HT29细胞增殖、迁移和侵袭能力且干扰miR-203a-3p抑制HT29细胞生物学行为的结果被沉默JDP2表达所逆转。

综上，干扰miR-203a-3p可通过上调JDP2的表达抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，miR-203a-3p/JDP2途径可能是结肠癌的预防、早期诊断、治疗和预后预测的新靶点。