miR-17-5p靶向PI3K/AKT信号通路调控皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的机制

郭金兰 甘才斌 张洁 董明亮 马新苹

(新乡市中心医院皮肤科，河南 新乡 453000)

皮肤鳞状细胞癌是一种起源于皮肤或其附属物的恶性肿瘤，已严重威胁人类的健康〔1〕。目前，临床主要采用手术、放疗、化疗和联合治疗等治疗方法，但由于这些治疗方法的局限性，并未产生理想的治疗效果〔2〕。因此，寻找具有更好疗效的新治疗方法显得至关重要。miR-17-5p是miR-17-92基因簇的重要成员，研究〔3，4〕表明，miR-17-5p的异常表达与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭转移密切相关。例如，miR-17-5p在口腔鳞状细胞癌中表达明显上调，miR-17-5p可通过抑制其下游靶基因SOCS6促进肿瘤细胞的增殖〔3〕；但miR-17-5p在三阴性乳腺癌中表达显著下调，过表达miR-17-5p可通过靶向下调ETV1抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭〔4〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路与癌症的相关性研究是近年来的研究热点。已有研究〔5～7〕表明，miRNA通过调控PI3K/AKT信号通路与胶质瘤、宫颈癌和甲状腺乳头状癌等多种恶性肿瘤的发生发展有关。例如，miR-489通过靶向spin1介导的PI3K/AKT通路抑制胶质瘤细胞增殖，诱导胶质瘤细胞凋亡〔5〕；miR-383通过下调PARP2抑制PI3K-AKT-MTOR信号通路抑制宫颈癌的发生〔6〕；miRNA-148a通过STAT3和PI3K/AKT信号通路抑制甲状腺乳头状癌细胞生长〔7〕。但尚无miR-17-5p在皮肤鳞状细胞癌的相关研究，且miR-17-5p能否通过介导PI3K/AKT信号通路参与调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡也尚未可知。因此，本研究探讨miR-17-5p靶向PI3K/AKT信号通路对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料与主要试剂、仪器 皮肤鳞状细胞癌A431细胞和人永生化角质形成细胞HaCaT购自美国ATCC。DMEM培养基和胎牛血清购自赛默飞公司；LipofectamineTM2000转染试剂和TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；Inhibitor-con、miR-17-5p inhibitor、WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1的构建和测序由上海生工公司提供；RIPA试剂、噻唑蓝(MTT)试剂、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印迹相关试剂均购自北京索莱宝公司。兔抗PIK3R1、p-AKT、p-PI3K、cyclinD1、Bcl-2和Bax抗体购于美国Abcam公司，兔抗β-actin抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于武汉博士德公司。胰岛素样生长因子(IGF)-1和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega公司；酶标仪购自美国Thermo公司；实时荧光定量(qRT)-聚合酶链式反应(PCR)仪购自美国ABI公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2细胞培养与转染 用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养A431和HaCaT细胞。定期观察细胞生长情况，当细胞融合度达到80%时，用胰酶消化进行传代。取对数生长期的A431细胞，以细胞密度为2×105个/孔接种于6孔板，当细胞融合度约为60%时，用LipofectamineTM2000将NC、Inhibitor-con和miR-17-5p inhibitor分别转染A431细胞。于细胞培养箱常规培养48 h后，进行后续实验分析。实验分组如下：NC组，Inhibitor-con组、miR-17-5p inhibitor(转染miR-17-5p inhibitor)组。为了进一步验证miR-17-5p是通过抑制PI3K/AKT信号通路来调控皮肤鳞状细胞癌细胞A431的增殖和凋亡，当A431细胞转染miR-17-5p inhibitor 48 h后，用100 ng/ml的IGF-1〔8〕处理1 h，随后进行后续实验分析。实验分为miR-17-5p inhibitor组(转染miR-17-5p inhibitor)和miR-17-5p inhibitor+IGF-1组(转染miR-17-5p inhibitor后，用IGF-1处理)。

1.3qRT-PCR检测 利用TRIzol试剂从HaCaT细胞及各组A431细胞中提取总RNA，将其逆转录为cDNA，随后以cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增。所有引物由北京华大基因提供。以U6作为miR-17-5p的内参，用2-ΔΔCt方法计算miR-17-5p的相对表达量。引物序列如下：miR-17-5p上游引物：5′-CTCTTACAGTGCAGGTAGAAAA-3′，下游引物：5′-GAGC-AGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；U6下游引物：5′-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3′。

1.4MTT法检测细胞增殖活力 将对数期A431细胞以每孔1×105个细胞数接种于96孔板，按照上述细胞转染方法向A431细胞转染miR-17-5p inhibitor或Inhibitor-con后，分别于转染后0 h、24 h、48 h、72 h时间点向每孔中加入MTT试剂20 μl，继续培养4 h后吸去孔内上清，向每孔中加入150 μl的DMSO，振荡10 min至完全溶解，用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度值(用空白孔进行调零)。为了证明IGF-1可以逆转抑制miR-17-5p表达对A431细胞增殖的影响，分别在转染0 h、24 h、48 h、72 h后，用100 ng/ml的IGF-1处理1 h，然后按照上述步骤检测细胞活力。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 取各组A431细胞，用胰酶消化后离心，弃上清液，收集各组细胞，用预冷的1×磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞2次，加入适量的1×结合缓冲液轻轻吹打重悬细胞，然后加入5 μl的Annexin V-FITC进行混匀，在室温条件下避光孵育15 min后，加入5 μl的PI染色，随后用流式细胞仪测定各组A431细胞的凋亡情况。

1.6Western印迹检测 用RIPA细胞裂解液裂解各组A431细胞，提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分别取30 μg各组细胞蛋白，煮沸5 min充分变性后，用SDS-PAGE凝胶分离蛋白，当电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜，用10%的脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入Western印迹洗涤液充分洗涤(3次×10 min/次)，分别加入稀释好的抗PIK3R1、β-actin、p-AKT、p-PI3K、细胞周期素(Cyclin)D1、Bax和Bcl-2蛋白的一抗4℃孵育过夜后，Western印迹洗涤液充分漂洗(3次×10 min/次)，加入HRP标记的二抗室温孵育膜1 h，Western印迹洗涤液充分漂洗(3次×10 min/次)后，用ECL试剂盒进行显色，利用灰度分析软件Image J对目的条带进行分析(以β-actin为内参)。

1.7双荧光素酶报告基因检测 利用靶基因预测数据库Target Scan (http：//www.targetscan.org)预测miR-17-5p的靶基因。发现miR-17-5p的5′端可与PIK3R1的3′-UTR特异性结合，猜测PIK3R1是miR-17-5p的靶基因。为验证这一猜想，构建野生型WT-PIK3R1和突变型MUT-PIK3R1的PIK3R1 3′-UTR荧光素酶报告载体。利用LipofectamineTM2000将miR-17-5p和miR-con分别与WT-PIK3R1和MUT-PIK3R1共转染A431细胞，然后将各组A431细胞于细胞培养箱内培养48 h，收集各组细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作步骤对各组A431细胞的荧光素酶活性进行检测。

1.8统计学方法 利用SPSS19.0软件进行t检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-17-5p在人永生化角质形成细胞HaCaT和皮肤鳞状细胞癌A431细胞中的表达 与HaCaT细胞中miR-17-5p表达量(0.81±0.12)比较，皮肤鳞状细胞癌A431细胞中(3.45±0.41)表达显著上调(t=10.704，P=0.000)。表明miR-17-5p在皮肤鳞状细胞癌A431细胞中呈高表达，在人永生化角质形成细胞HaCaT中呈低表达。

2.2抑制miR-17-5p表达对A431细胞增殖的影响 与NC组和Inhibitor-con组比较，miR-17-5p inhibitor组A431细胞中miR-17-5p的表达显著降低(P<0.001)。表明成功构建了抑制miR-17-5p表达的A431细胞株。与NC组和Inhibitor-con组相比，miR-17-5p inhibitor组A431细胞在0 h、24 h时间点细胞增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时A431细胞增殖活力显著降低，CyclinD1蛋白的表达显著降低(均P<0.01)，见表1和图1。提示抑制miR-17-5p表达可抑制A431细胞的增殖。

表1 抑制miR-17-5p表达对A431细胞增殖的影响

1～3：NC组,Inhibitor-con组,miR-17-5p inhibitor组，图2、4同图1 Western印迹检测抑制miR-17-5p表达后A431细胞CyclinD1的表达

2.3抑制miR-17-5p表达对A431细胞凋亡的影响 与NC组和Inhibitor-con组比较，miR-17-5p inhibitor组A431细胞的凋亡率显著增加，促凋亡蛋白Bax的表达显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(均P<0.001)。见图2、表2。表明抑制miR-17-5p表达可促进A431细胞凋亡。

图2 Western印迹检测抑制miR-17-5p表达对A431细胞凋亡的影响

表2 抑制miR-17-5p表达对A431细胞凋亡的影响

2.4miR-17-5p靶向调控PIK3R1的表达 图3A结果显示，miR-17-5p与WT-PIK3R1的3′UTR之间存在特异性结合位点。野生型PIK3R1基因荧光素酶表达载体WT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共转染A431细胞后，miR-17-5p组A431细胞荧光素酶活性较miR-con组明显降低(P<0.01)；而突变型PIK3R1基因荧光素酶表达载体MUT-PIK3R1和miR-17-5p mimics共转染A431细胞后，miR-17-5p组A431细胞荧光素酶活性较miR-con组差异不显著(P>0.05)。见图3B、表3。与mimic-con组A431细胞PIK3R1蛋白的表达量(0.76±0.14)比较，miR-17-5p mimic组(0.32±0.05)显著减低；与inhibitor-con组A431细胞PIK3R1蛋白表达量(0.71±0.11)比较，miR-17-5p inhibitor组(1.32±0.19)显著升高(P<0.05)。提示PIK3R1是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p可负性调控PIK3R1的表达。

1～4:mimic-con组，miR-17-5p mimic组，inhibitor-con组，miR-17-5p inhibitor组;A：通过TargetScan对miR-17-5p和结合进行预测示意图；B：Western印迹检测PIK3R1蛋白表达图3 miR-17-5p靶向调控PIK3R1的表达

表3 miR-con或miR-17-5p与报告质粒共转染A431细胞后双荧光素酶活性检测

2.5抑制miR-17-5p表达对PI3K/AKT信号通路下游蛋白表达的影响 与NC组和Inhibitor-con组比较，miR-17-5p inhibitor组A431细胞中p-AKT和p-PI3K蛋白的表达显著降低(均P<0.001)。见图4，表4。表明抑制miR-17-5p表达可抑制A431细胞中PI3K/AKT信号通路下游蛋白的表达。

图4 Western印迹检测p-AKT和p-PI3K蛋白的表达

表4 Western印迹检测p-AKT和p-PI3K的蛋白表达

2.6PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1可以逆转抑制miR-17-5p表达对A431细胞的增殖抑制和凋亡促进作用 与Inhibitor-con组比较，miR-17-5p inhibitor组A431细胞在0 h、24 h时间点细胞增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时A431细胞增殖活力显著降低，A431细胞凋亡率显著升高，p-AKT和p-PI3K蛋白的表达显著降低(均P<0.05)；与miR-17-5p inhibitor组比较，miR-17-5p inhibitor+IGF-1组A431细胞在0 h、24 h时间点细胞增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h时A431细胞增殖活力显著升高，A431细胞凋亡率显著降低，p-AKT和p-PI3K蛋白的表达显著升高(均P<0.05)。见图5，表5，表6。以上结果表明，PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1可逆转抑制miR-17-5p表达对A431细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。

1～3:Inhibitor-con组、miR-17-5p inhibitor组、miR-17-5p inhibitor+IGF-1组图5 Western印迹检测p-AKT、 p-PI3K蛋白表达

表5 IGF-1处理转染miR-17-5p inhibitor的A431细胞增殖和凋亡情况

表6 Western印迹检测p-AKT、 p-PI3K蛋白表达

3 讨 论

miR-17-5p属于miR-17家族，编码基因位于人类13q31和啮齿类14qE4染色体上，已有研究〔9～11〕发现，miR-17-5p在宫颈癌中高表达，通过靶向转化生长因子β受体(TGFBR)2促进宫颈癌的增殖和转移；miR-17-5p还可通过靶向p21促进鼻咽癌细胞增殖和肿瘤发生。然而，在前列腺癌中，miR-17-5p表达下调，过表达miR-17-5p可抑制癌细胞的生长和雄激素受体的转录活性。PI3K/AKT信号通路是恶性肿瘤中最活跃的信号通路之一，PI3K由一个催化亚基和一个调节亚基构成，PIK3R1基因编码的p85α是主要的调节亚基，p85α通过与催化亚基p110结合，抑制p110的催化活性，抑制PI3K/AKT通路的活化。PI3K/AKT信号通路相关基因的异常表达是多种恶性肿瘤发生发展的常见驱动因素。研究〔12～14〕发现，多种miRNA通过调控PI3K/AKT信号通路相关基因的表达影响癌症的发生发展。如miR-106b和miR-93通过PI3K/AKT通路抑制PTEN来调控乳腺癌的进展〔12〕；miR-451通过下调PI3K/AKT通路抑制人结肠癌细胞生长〔13〕；miR-497通过靶向胰岛素样生长因子1受体(IGFR)1可抑制结肠癌细胞的存活、增殖和侵袭〔14〕。但miR-17-5p和PI3K/AKT信号通路在皮肤鳞状细胞癌中作用尚不清楚。

PIK3R1的异常表达，可减少p85α对p110的抑制作用，甚至干扰p85α对其他基因的调控，导致PI3K/AKT信号通路的意外活化，促进肿瘤的发生发展〔15～17〕。本研究结果表明抑制miR-17-5p表达可能通过上调PIK3R1，增强p85α对p110的抑制作用，抑制PI3K/AKT信号通路的活化，进而抑制PI3K/AKT信号通路下游蛋白p-AKT和p-PI3K的表达，从而抑制A431细胞的增殖，促进其凋亡，IGF-1可逆转抑制miR-17-5p表达对A431细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。王延东〔18〕研究发现，miR-455-3p.1也可通过靶向下调PIK3R1基因表达，促进p-AKT蛋白表达，促进肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭与转移。提示miR-17-5p可能通过下调PIK3R1基因，激活PI3K/AKT信号通路，促进p-AKT和p-PI3K蛋白的表达，参与皮肤鳞状细胞癌的发生发展。