黄瓜新品种‘科润99’种子纯度SSR 鉴定

赵海燕 刘 楠 房文文 杜胜利 崔洪宇

（天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所/蔬菜种质创新国家重点实验室 天津300192）

黄瓜（Cucumis sativus L.）为葫芦科黄瓜属植物，在我国被广泛种植，是大众餐桌上的主要蔬菜之一。黄瓜种子品质的优劣直接影响着黄瓜的品质与产量[1-3]。 黄瓜种子的纯度通常受制种基地隔离措施、制种户对制种规程的执行力等综合因素的共同影响。随着我国黄瓜种业市场化程度日益提高，使得快速、有效地鉴别双亲、混杂品种和真实杂交种成为必然。以往常规的田间纯度鉴定主要是形态鉴定法， 很大程度上依赖于育种家对种子、幼苗、成年植株、叶、花、花粉、果实等器官的颜色、刺瘤、瓜把等农艺性状作为鉴定的观察指标，该方法的优点是简单、方便、直观，但鉴定周期长、工作量大，容易受季节、栽培措施及环境因素的限制，往往准确度欠佳。 品种的纯度和真伪鉴定本质上是对其基因型的鉴定, 田间形态学鉴定尤其是对亲缘关系较近的品种往往很难区分， 而且有的新品种本身就缺乏可供鉴定的新农艺性状，另外还要求鉴定者对品种的特征非常熟悉，具有一定的工作经验。 上述的诸多问题均可能影响后期品种纯度鉴定的准确程度， 进而也给后期良种的推广使用造成影响， 因此采用更为合理高效的检测方法十分必要[1,4-6]。

随着DNA 分子标记技术的出现，使品种纯度鉴定有了良好的技术平台和更为适合的技术手段。DNA 在生物体各组织、各发育阶段均可检测到，并且可以在种子发育后的各个时期、各个阶段采集样本，因此其具有标记可遍布整个基因组、无组织特异性、不受外界环境影响等优点， 而且其遗传稳定性好。SSR 标记，即简单序列重复，具有数量丰富、在基因组中分布均匀、多态性高、共显性遗传、重复性好、操作简单、不受环境因素影响等优点，同时又因SSR 引物共显性的特点在杂交种纯度鉴定具有独特优势[1]，非常适合于高通量分析[5,7]。SSR 分子标记已经大规模的成熟应用于黄瓜品种纯度鉴定， 同时也已广泛应用于茄子[8-9]、油菜[10]、甘蓝[11]、甜瓜[7]等蔬菜作物杂交种纯度鉴定中。

本文作者利用SSR 标记对天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所育成的黄瓜新品种‘科润99’及其父、母本的种子纯度进行鉴定，旨在为‘科润99’种子纯度鉴定提供参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

‘科润99’黄瓜杂交种及其父、母本，由天津科润黄瓜研究所生物技术室提供。

1.2 DNA 提取

本试验采用CTAB 法提取黄瓜基因组DNA，方法同崔兴华等（2015）。

1.3 特异引物筛选

以上述提取的DNA 为模板， 165 对引物进行PCR 扩增， 选取父本、 母本、 F1各 2 粒， 扩增产物经8% PAGE 凝胶电泳、 染色、 显色后进行分析，依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置进行试验分析。 试验结果中选取杂交种和父母本间存在共显性分离的引物， 对比分析从而应用于该品种的纯度检测。

PCR 采用 10 μL 扩增体系： 模板 DNA10 ng、上游引物和下游引物各25 ng、2×Taq PCR Master Mix（包含 Taq、Buffer、Mg2+、dNTP）5.0 μL，3.96 μL 灭菌去离子水。

扩增程序：95℃预变性 300 s，95℃变性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 60 s，32 个循环；72℃再延伸350 s。

1.4 特异引物的验证

试验时间为2019 年4～12 月。 在试验田中随机选取220 株‘科润99’黄瓜植株进行田间生物学性状观察， 同时于实验室中提取对应植株的DNA 进行SSR 扩增， 将田间纯度鉴定结果与SSR 分子标记纯度鉴定结果进行对比分析， 从而验证筛选到的引物对‘科润99’种子纯度鉴定的准确性。

2 结果与分析

2.1 ‘科润99’特异引物筛选

选用165 对 SSR 引物在‘科润 99’及父、母本间进行特异谱带的筛选，通过PCR 扩增及电泳分离，有10 对引物在亲本间表现为共显性分离（图1），‘科润99’表现为双亲互补带型。

图1 科润99 部分引物筛选图谱

2.2 ‘科润99’特异引物纯度鉴定的验证

将初步筛选出的10 对SSR 引物，再次对田间所栽培的220 株 ‘科润99’ 黄瓜植株进行SSR 纯度鉴定，观察试验结果，从而对所选出的引物是否可以鉴定 ‘科润99’种子纯度进行评估、验证。 试验结果表明（附表、图2、图3），10 对引物的扩增产物的电泳谱带中‘科润99’的条带均为父、母本互补带型，与上述筛选结果表现一致。 其中引物N216 和N221 不纯种子的检出率分别为2.27%和1.82%，田间鉴定不纯率为2.73%， 二者纯合种子的符合率在99.0%以上，并且这两对引物扩增的条带清晰、 带型整齐， 特异性强。由此可见，这两对SSR 标记可以作为‘科润99’种子纯度鉴定的特异分子标记，从而用于纯度检测。 同时也表明在SSR 分子标记技术结果的可靠性、 准确性，决定其可以对黄瓜品种进行纯度鉴定。

图2 引物N216 对科润99 及其亲本扩增图谱

图3 引物N221 对科润99 及其亲本扩增图谱

附表 SSR 分子标记鉴定与田间鉴定比较

3 结论与讨论

试验结果显示，165 对SSR 引物中筛选出在 ‘科润99’ 的亲本间表现较好的多态性的引物有10 对。其中N216 和N221 这两对引物在试验中表现更为优秀，试验结果与田间鉴定结果进行对比发现，这两对SSR 引物与田间纯度鉴定结果高度吻合，二者符合率在 99.0%以上。 因此，SSR 标记 N216 和 N221 的室内分子检测方法可以应用于替代田间‘科润99’黄瓜种子的纯度鉴定，成功的解决了田间鉴定周期长、容易受环境条件等影响的问题，同时也降低了财力、物力和人力消耗。

近年来天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所已将SSR 技术熟练地应用于本单位多个黄瓜杂交种的纯度鉴定， 从而保证本公司的产品可以及时的投入市场。 每一个品种在基因型上都是非常稳定的， 以此为基础即可使用SSR 分子标记技术检测出某些位点的纯度， 当某一品种种子中混入其亲本自交种或其他品种种子时，SSR 分子标记通过检测该样品植株间基因型的差异，即可分辨出来。 通常对于母本自交的种子，可以采用单引物检测方法，即可把其杂交种和其父母本杂株区别开来。 但如果检测样品存在异源花粉的F1或机械混杂种子时， 即需要采用多对SSR 引物同时对该样品进行检测， 从而提高检测结果的准确程度。