1例摩氏摩根菌引起BALB/c小鼠感染的诊治

邹 玲，孔垂民，殷 茵，刘焕奇，刘文华

(青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109)

摩氏摩根菌为兼性厌氧的革兰阴性杆菌，能够诱导β-内酰胺酶，对多种抗生素具有抗性。该菌广泛存在于自然界、人及多种动物的胃肠道中，为条件致病菌，可引起人兽感染[1]。1980年在人膝关节炎病例中首次发现摩氏摩根菌[2]，对于其引起感染的报道主要集中在人的脑膜炎、关节炎、心包炎和眼内膜炎等炎症病例中[3]，关于动物感染的报道较少。近来在水产动物研究中有摩氏摩根菌感染的报道[4-5]。Zhao等首次报道鸡感染摩氏摩根菌引起群体死亡[6]。但未见有关于实验动物大范围感染摩氏摩根菌的报道。BALB/c小鼠为近交系小鼠，具有遗传基因纯、个体差异小等特点，是生命科学领域经常选用的实验动物。本试验对2018年11月某实验动物养殖场送检的一批消瘦、被毛粗乱的BALB/c小鼠进行了实验室检测，具体报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及主要试剂 某实验动物养殖场送检的疑似患病BALB/c小鼠10只、健康的BALB/c小鼠20只。PCR试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 送检BALB/c小鼠的临床诊断 对送检的BALB/c小鼠进行断颈处死，经浸泡消毒后进行剖检。

1.3 细菌的分离与镜检 无菌操作对剖检发现有明显病变的肝脏及肠系膜淋巴结进行细菌的分离，接种于普通营养培养基及SS培养基，培养24 h，取单菌落进行三代纯化。挑取纯化好的单菌落进行革兰染色，观察菌体形态。

1.4 细菌的16S rRNA基因测序及系统进化树构建 挑取单菌落于LB培养基中摇菌12 h作为PCR反应的模板，利用16S rRNA基因的通用引物27F和907R进行PCR扩增，预期目的条带为900 bp。反应体系：2×TaqMaster Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 12 μL。反应程序：94 ℃ 10 min； 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，将与目的条带一致的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果利用NCBI的Blast进行比对，从GenBank中下载同源性较高序列，利用MEGA 7.0中的最大简约法制作进化树，进行遗传进化关系分析。

1.5 动物回归试验 以109CFU/mL的分离菌菌液分别经腹腔注射和灌胃途径各攻毒5只健康BALB/c小鼠，每只0.2 mL，同时设生理盐水对照组，相同条件下进行隔离饲养观察。

1.6 药敏试验 为了筛选敏感药物以对疾病进行有效控制，采用常规的药敏纸片扩散法进行药敏试验，根据《欧盟药敏试验标准》判定细菌对药物的敏感性，选择敏感药物进行治疗。

2 结果

2.1 临床病理变化 剖检病变小鼠可见，小鼠的肝脏肿大，表面遍布出血点(中插彩版图1A)，肠系膜淋巴结显著肿大、瘀血，肠道可见出血点(中插彩版图1B)。 脾脏淤血呈暗红色(中插彩版图1C)。

图1 患病小鼠剖检器官病变A: 肝脏肿大、出血; B: 肠系膜淋巴结肿大、淤血; C: 脾脏呈暗红色

2.2 细菌的分离与镜检 无菌操作对发病鼠进行细菌分离。经24 h培养，在普通营养琼脂和SS琼脂中均有菌落长出，普通营养琼脂上菌落呈灰白色、不透明，在光照下有淡绿色光泽。在SS平板上为无色、透明、圆形菌落。纯化细菌经染色镜检可见两端钝圆的革兰阴性小杆菌。

2.3 细菌的16S rRNA基因测序及系统进化树分析 使用16S rRNA基因的通用引物进行菌液PCR扩增，结果得到了预期900 bp左右的单一目的条带(图2)。测序结果经比对，显示分离菌株与摩氏摩根菌(序列号为JX049341.1)有99%同源性，可确认分离细菌为摩氏摩根菌。

图2 PCR电泳检测结果M：DL2 000 marker； 1：阴性对照； 2：临床分离株

在GenBank下载与分离菌株同源性较高的基因序列，利用MEGA 7.0制作进化树，进行遗传进化关系分析。由图3可知，本试验分离菌株与在大鲵分离到的基因号为JX049341.1的摩氏摩根菌同源性最高，可达66%。

图3 分离菌的16S rRNA系统进化树注：框内为本试验分离菌株

2.4 攻毒试验 腹腔注射组小鼠于攻毒17 h后全部死亡，剖检可见攻毒小鼠肝脏、脾脏严重出血、淤血，肠系膜肿大、出血，与临床发病小鼠症状一致。灌胃组小鼠于攻毒18 h后开始出现精神沉郁现象，28 h全部死亡，剖检症状同上。对照组小鼠健康存活。综合细菌鉴定和攻毒试验结果，确诊此次疫情由摩氏摩根菌引起。

2.5 药敏试验 纸片扩散法药敏试验结果见表1。由表1可知，分离菌株的耐药率达75%，仅对新霉素、链霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考敏感。

表1 分离菌株的药敏试验

2.6 治疗效果 根据药敏试验结果，同时考虑药物间的协同作用和药物代谢途径等因素，选择新霉素和氟苯尼考进行联合用药，同时加强了通风换气和环境消毒，结果大群在用药2 d即表现出明显好转，连续用药5 d完全控制了病情，鼠群恢复了健康。

3 讨论

根据养殖场中BALB/c小鼠的发病情况及临床剖检症状，初步判定该养殖场存在传染性疾病，通过细菌的分离鉴定及动物回归试验，确诊了疫情是由摩氏摩根菌引起。摩氏摩根菌是一种人兽共患病病原菌，该菌主要引起多种炎症反应及实质器官充血、出血[7]。根据剖检症状可知，本试验分离到的摩氏摩根菌主要侵害小鼠的肝脏、脾脏及肠道等脏器。

动物回归试验结果表明，通过腹腔注射及灌胃2种攻毒途径均可引起小鼠死亡，腹腔注射组攻毒13 h即出现小鼠死亡现象，剖检显示内脏器官出血、充血现象明显，说明分离的菌株毒力很强，灌胃组的剖检与临床发病小鼠症状基本一致，说明该菌很可能经消化道途径感染。16S rRNA基因构建的系统进化树表明，本试验分离菌株与2012年在四川成都的患病大鲵体内分离的基因号为JX049341.1的摩氏摩根菌在同一分支，进一步说明该菌分布广泛，致病力强。

选用针对革兰阴性菌的16种药物进行药敏试验，结果显示，分离菌株耐药性很强，仅对新霉素、氟苯尼考等4种药物敏感。摩氏摩根菌能够诱导产生多种β-内酰胺酶，对β-内酰胺类药物具有一定的抗性[8]，但有报道表明摩氏摩根菌对部分头孢类药物敏感[9]，这可能与不同菌株诱导产生β-内酰胺酶的种类活性不同有关。新霉素内服很少吸收，便于对肠道病原菌产生杀菌作用；氟苯尼考吸收快，分布广，能够较长时间维持有效血药浓度，利于杀灭侵入内脏器官的细菌，2种药物联合使用有利于对疾病及时有效控制。

摩氏摩根菌作为机会致病菌只有在宿主抵抗力降低的条件下才会引起发病，BALB/c小鼠作为近交系小鼠远比不上昆明系等实验鼠对外界不良环境的抵抗力强，其发病与养殖环境密切相关。经了解该养殖场BALB/c小鼠养殖车间存在养殖密度大，通风不良导致氨味浓重以及消毒不彻底等问题，这些因素会导致小鼠抵抗力下降，从而增加病原易感性，所以实验动物养殖场要遵循动物福利基本要求，首先为实验动物提供良好的饲养环境，保持适宜的温度、湿度和合理的饲养密度，加强通风换气和环境消毒频率，确保垫料卫生并及时更换，重视饲料营养水平，提高机体免疫力，从而降低患病机率。