四川省甘孜州藏绵羊梨形虫感染情况的调查

蓝 岚，杨丹娇，潘 瑶，吴建平，李友英，贺安祥，汤 承

(1. 西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041 ； 2. 甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000 ； 3. 四川省肉牛创新团队，四川 成都 610041)

四川省甘孜藏族自治州(简称甘孜州)位于青藏高原东南缘，是川西北生态示范区和国家生态屏障区。畜牧业是甘孜州基础产业、传统产业和优势产业，藏绵羊是甘孜州的优势和标志性物种之一，也是高原牧民重要的生产生活资料。梨形虫病是一种蜱传寄生虫病[1]，在热带、亚热带和温带地区广泛分布[2]。梨形虫可感染牛、羊、马、犬、野生动物，其中部分虫种如分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens,B.divergens)、田鼠巴贝斯虫(B.microti)和猎户巴贝斯虫(B.venatorum)还可以感染人[3-4]。梨形虫病的典型临床特征为发热、溶血性贫血、血红蛋白尿等，严重者可导致死亡[5]； 亚临床感染可出现生长发育迟缓、繁殖性能下降等，给畜牧业带来极大的经济损失[6]。杨辅国等[7]、陈德明等[8]先后对甘孜州部分地方绵羊泰勒焦虫病流行情况进行报道，此后再没有其他相关报道。近年来，甘孜州养羊数量锐减，藏绵羊养殖数量已从2016年的104万多头减至2019年的46万余头，很多地方已不再养殖藏绵羊，选择甘孜州藏绵羊养殖的主要区域泸定、丹巴等9个县开展甘孜州藏绵羊梨形虫感染情况调查，对今后甘孜州藏绵羊养殖产业持续、健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 血液样本 本调查于2018年6月—2019年5月 采集甘孜州9个县临床健康羊全血352份，样本信息如下：乡城县19份，泸定县43份，色达县33份， 甘孜县121份，得荣县14份，丹巴县30份，石渠县32份，白玉县30份，炉霍县30份。

1.2 仪器设备 隔水式恒温培养箱，购自Thermoforma公司；高速离心机，购自Eppendorf 公司；DYY-6型电泳仪，购自北京市六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 全血总DNA提取 采用酚-氯仿法来进行全血总DNA的提取。

1.3.2 检测方法 采用西南民族大学动物医学实验室建立的梨形虫的巢式PCR方法进行检测[9]。引物信息：外上游引物：5′-GATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′，外下游引物：5′-ATCGTCTTCGATCCCCTAACT-3′，扩增片段大小为843 bp；内上游引物：5′-AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG-3′，内下游引物：5′-GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC-3′，扩增片段大小为750 bp，靶基因为18S rRNA。反应体系：第1轮反应预混酶12.5 μL，外引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)， 第1轮样本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。第2轮反应预混酶12.5 μL,内引上、下游引物各1 μL(10 μmol/μL)，样本DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：第1轮反应94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min；16 ℃反应结束。第2轮反应95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火20 s， 72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃反应结束。将第2轮PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.3 虫种鉴定 从9个县随机挑选68份藏绵羊梨形虫核酸阳性样本PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到梨形虫序列。通过NCBI上的BLAST比对，运用Lasergene 7.0 软件对测得序列进行同源性分析，采用MEGA 7软件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值为1 000)基于梨形虫序列构建系统进化树来鉴定梨形虫虫种。

1.4 检测情况统计分析 对9个县藏绵羊检测情况统计，按照半农半牧业县(乡城、泸定、得荣、甘孜、丹巴、炉霍6个县)和纯牧业县(色达、石渠、白玉3个 县)来划分进行结果汇总，用SPSS 20.0软件统计分析其差异显著性。

2 结果

2.1 甘孜州藏绵羊梨形虫的检测 本试验采集的352份藏绵羊全血样本经巢式 PCR扩增其18S rRNA部分基因序列，其中有147份样本扩增出目的条带(750 bp)，梨形虫平均阳性率为41.76%，部分电泳结果见图1。

图1 部分藏绵羊梨形虫巢氏PCR产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of some nesed-PCR products of Tibetan sheep PiroplasmaM：DL 2 000 DNA 标准； 1～12：藏绵羊全血样本；N：阴性对照； P：阳性对照M：DL 2 000 DNA marker； 1-12：Blood sample of Tibetan sheep；N：Negative control； P：Positive control

2.2 半农半牧县和纯牧业县藏绵羊梨形虫的检测 甘孜州9个县中半农半牧业县检出梨形虫核酸阳性样本124份，平均阳性率为48.25%。纯牧业县检出梨形虫核酸阳性样本23份，平均阳性率为24.21%，见表1。通过统计分析发现，甘孜州半农半牧县藏绵羊梨形虫感染率显著高于纯牧业县(P<0.05)。

表1 甘孜州半农半牧县和纯牧业县藏绵羊梨形虫检测结果Table 1 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in the semi-agricultural and semi-pastoral counties and pure animal husbandry counties in Ganzi prefecture

2.3 甘孜州藏绵羊梨形虫虫种的鉴定 从甘孜州7个县(除白玉县和色达县)的藏绵羊梨形虫阳性样本中随机挑选68份样本通过PCR产物测序鉴定虫种。成功鉴定虫种3个，其中吕氏泰勒虫46份，阳性检出率为67.65%；绵羊泰勒虫14份，阳性检出率为20.59%；奥氏巴贝斯虫3份，阳性检出率为4.41%。各县梨形虫虫种情况见表2。

表2 甘孜州藏绵羊梨形虫虫种检测结果Table 2 Detection results of Tibetan sheep Piroplasma in Ganzi prefecture

基于PCR产物测序结果进行同源性比对分析并构建进化树鉴定藏绵羊梨形虫虫种。结果显示，甘孜州藏绵羊感染的46株泰勒虫序列与GenBank中吕氏泰勒虫陕西株(MG930123)、缅甸株(LC326005)、贵州株(LC326005)聚为一大支且同源性>99%，鉴定为吕氏泰勒虫；感染的14株泰勒虫序列与GenBank中绵羊泰勒虫伊朗株(KX273858)、土耳其株(KT851438)聚为一大支且同源性>99%，鉴定为绵羊泰勒虫；感染的3株巴贝斯虫序列与GenBank中奥氏巴贝斯虫云南株(KY805843、KY805842、KY805840)聚为一大支且同源性>99%，鉴定为奥氏巴贝斯虫。

2.4 甘孜州藏绵羊梨形虫地域分布 甘孜州7个县中藏绵羊吕氏泰勒虫分布于泸定县、丹巴县、乡城县、得荣县、炉霍县和甘孜县，绵羊泰勒虫分布于乡城县和石渠县，奥氏巴贝斯虫分布于乡城县。

3 讨论

本试验是首次对甘孜州州内主要藏绵羊养殖的9个县开展藏绵羊梨形虫感染情况调查，藏绵羊梨形虫平均阳性率达到41.76%，因采集样本均为临床健康样本，说明甘孜州藏绵羊梨形虫亚临床感染严重。甘孜州半农半牧业县海拔较低、气候适宜、植被种类多、牲畜流动大，适合蜱活动和繁殖，藏绵羊梨形虫感染率显著高于纯牧业县，试验结果与胡广卫等[10]对青海羊泰勒虫病流行情况调查结果一致，在一些农区、半农半牧区、林区的边缘及有灌木林存在的地方羊泰勒虫病常呈地方性流行。

本试验共鉴定藏绵羊梨形虫虫种3个，其中吕氏泰勒虫感染率为67.65%，为甘孜州优势虫种；Zhang等[11]对甘肃省舟曲县绵羊血液进行检测发现舟曲县吕氏泰勒虫检出率为67%；钟维等[9]对采自四川阿坝州壤塘、小金、红原县的藏绵羊全血进行检测，结果显示，吕氏泰勒虫阳性率为75.0%。综上结果表明，吕氏泰勒虫在青藏高原绵羊中广泛分布。吕氏泰勒虫为恶型泰勒虫，泰勒虫子孢子随蜱虫盯咬进入宿主体内，以裂殖生殖的方式进行繁殖。在繁殖阶段，裂殖体可引起淋巴细胞大量增殖，被感染的动物表现出贫血及不同水平的虫血症，严重者甚至造成宿主死亡[12-13]。本次试验未对梨形虫传播媒介蜱的种类与分布进行调查，需要进一步进行调查研究，同时，由于感染情况较为严重，下一步有必要开展甘孜州藏绵羊梨形虫病的防治工作。