2株毒力不同M.bovis 差异表达蛋白的定量检测及分析

李梦莹，田 帅，董玉惠，马小静，张淮瑜，宋阿北，周向梅，许立华

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021 ； 2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

蛋白组学技术串联质谱标记(Tandem mass tag，TMT)与液相色谱质谱联用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相结合是一种基于标记定量的新技术，可以对多个样品进行蛋白质和多肽的定量分析[1]。TMT是定量蛋白质组学中最常用的同位素标记方法，它对蛋白质的相对表达量提供了准确性和可重复性。该方法可对鉴定的蛋白质进行相互验证，为牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)的毒力蛋白以及致病性提供依据。

M.bovisC68004菌株是20世纪50年代从1头患有结核病的牛组织中分离得到，M.bovisN菌株是2015年从具有典型全身性结核病症状的犊牛大脑中分离出来。程广宇等对这2株细菌在小鼠模型上的致病性进行了研究，发现M.bovisN感染的小鼠肺部和脾脏的病变程度比M.bovisC68004感染的小鼠更为严重[2]。然而，仍然不清楚这2个菌株的毒力因子差异，以及它们在激发宿主免疫反应的不同是否与其蛋白表达差异有关。因此，本试验将2株牛分枝杆菌进行蛋白组学分析，找出差异表达蛋白，并分析这些差异蛋白对其致病性及毒力的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株M.bovis(菌株号:C68004菌和N菌)由中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与制备 2株菌株均在添加10% OADC(油酸、牛血清蛋白V、右旋糖、过氧化氢酶)和1% Tween80的Middlebrook 7H9(BD Biosciences公司)液体培养基中培养。细菌OD值为0.6～0.8，3 000～5 000 g离心5～15 min，去上清，PBS洗涤沉淀3次，液氮速冻，菌体-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白样品制备方法(匀浆裂解法[3]) 取菌体沉淀加入适量SDT裂解液，转移至预先装有适量石英砂(组织样品另外加入1颗1/4英寸陶瓷珠)的2 mL离心管中，用美国MP匀浆仪进行匀浆破碎(24 s×2，6.0 m/s，60 s，2次)。然后超声(80 W，工作10 s，间歇15 s，循环10次)，沸水浴15 min。14 000 g 离心40 min，取上清采用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液。采用BCA(Bicinchoninic acid，BCA)法进行蛋白质定量。分装样品，-80 ℃保存。

1.2.3 TMT标记与分级 各样品分别取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT标记试剂盒说明书进行标记。将每组标记后的肽段等量混合，采用High pH RP spin column进行分级(使用指南：Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit)。肽段标记混合冻干后取100 μg，使用300 μL 0.1%三氯乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)稀释，转移到High pH RP spin column后离心收集FT组分，加入300 μL纯水，离心收集wash组分，然后开始梯度洗脱。样品冻干后用12 μL 0.1% FA复溶，OD280测定肽段浓度[4]。

1.2.4 质谱分析 每份样品采用纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离，样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析[5]。分析时长为60/90 min(根据具体试验方案而定)，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1 800 m/z，一级质谱分辨率在200 m/z为70 000，AGC target为3e6，一级Maximum IT为10 ms，Dynamic exclusion为40.0 s[5]。

1.2.5 平行反应验证(Parallel reaction monitoring validation，PRM) 根据TMT标签制备肽，每个样品中加入稳定同位素肽段作为内部标准参考[6]。在反相层析之前，将胰蛋白酶肽吸附到C18去盐柱上[6]。使用5%～35%乙睛作为液相色谱梯度。在Q Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)上进行PRM分析，利用每个目标蛋白的高强度和可靠度独特肽，形成最显著电荷状态和保留时间的目标肽[6]。质谱仪正离子工作模式参数如下：全MS扫描分辨率为70 000(200 m/z)，自动增控(Automatic gain control，AGC)目标值为3.0×10-6，最大离子注入时间为250 ms。完成MS扫描后，进行20次PRM扫描，扫描分辨率为35 000(200 m/z)。每个显著目标蛋白的单个肽段序列信号强度相对于每个样本进行量化和统一作为标准参考[6]。

1.2.6 数据分析 质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库鉴定及定量分析。

Gene Ontology (GO)功能注释：DEPs序列在UniProtKB数据库中搜索，同时使用SwissProt数据库、NCBI BLAST软件查找相关功能[7-8]。利用BLAST2GO对目标蛋白质集合进行GO注释的过程大致可以归纳为序列比对(BLAST)、GO条目提取、GO注释和补充注释等4个步骤[9]。

KEGG通路分析：DEPs FASTA序列利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)在线数据库进行比对，并提取相应KEGG通路[10]。对目标蛋白质集合进行KEGG通路注释时，利用KAAS (KEGG automatic annotation server)软件，首先通过比对KEGG GENES数据库，将目标蛋白质序列进行KO归类，并根据KO归类自动获取目标蛋白质序列参与的通路信息[10]。

蛋白质聚类分析(Clustering)[7]：进行聚类分析时，首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理。其次，使用Cluster 3.0软件对获得的表达蛋白质数据进行处理，并使用Java Tree view软件生成层次聚类热图。同时，采用欧几里得算法计算并绘制热图。进行聚类分析时，首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理。其次，使用Cluster 3.0软件同时对样品和蛋白质的表达量2个维度进行分类。最后，使用Java Trewview软件生成层次聚类热图。

蛋白质相互作用网路分析(PPI)：首先从目标蛋白质序列来源的数据库中获取目标蛋白质的Gene Symbol，利用这些Gene Symbol在IntAct (http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)或者STRING (http://string-db.org/)数据库中查找有试验证据的目标蛋白质之间的直接和间接相互作用关系，并使用CytoScape 软件(版本号：3.2.1)生成相互作用网络并对网络进行分析[7]。

2 结果

2.1 差异蛋白总数M.bovisN和M.bovisC68004菌体蛋白经胰酶消化后得到多肽。然后用高分辨率LC-MS/MS富集和分析肽，检测各鉴定肽的质量误差，结果证实MS数据的准确性(中插彩版图1A)。得到的肽段长度分布在3～29，符合胰蛋白酶肽的性质(中插彩版图1B)，并对不同肽序列的数量也进行了评估(中插彩版图1C)。蛋白质定量结果以火山图的形式显示(中插彩版图1D)，利用t检验(Student’s Test)得到的褶皱变化和P绘制火山图，显示2组样品之间的显著差异。

图1 M.bovis N和M.bovis C68004蛋白质定量检测Fig. 1 Proteome-wide identification of M.bovis N and M.bovis C68004A：质谱误差分布； B：肽段长度分布； C：肽段数量评估； D：蛋白定量火山图A:Mass error distribution; B:Peptide length distribution; C:Peptide count distribution; D:Volcano plot of protein quantification

本试验采用TMT定量蛋白质组学技术，共鉴定了2株M.bovis中2 174个共有蛋白。根据标准筛选差异显著蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs)表达变化的倍数超过1.2倍或小于0.83倍，同时P<0.05 (表1)。M.bovisN和M.bovisC68004 DEPs数量如表2所示，250个DEPs表达上调，229个DEPs表达下调。

表2 M.bovis N和M.bovis C68004显著差异蛋白数量Table 2 Overall of DEPs numbers of M. bovis N and C68004

2.2 分层聚类分析(Hierarchical cluster analysis) 根据显著性差异进行层次聚类分析，结果表明，所选择的蛋白(组间差异显著)具有良好的特异性，能准确筛选并较好地反映N和C68004之间的蛋白质组整体变化。

2.3 Gene Ontology(GO)分析 GO分析2株菌之间的DEPs，如中插彩版图2所示，图中横轴为生物过程(Biological process,BP)和分子功能(Molecular function,MF)，纵轴为DEPs蛋白数量。与基因表达调控、DNA转录、RNA生物合成等生物过程相关的DEPs均为20个左右(RichFactor相似)，如基因表达调控，22个显著DEPs，RichFactor=0.42(N/C68004)。分子功能中富集最多的是DNA结合，45个显著DEPs，RichFactor=0.3(N/C68004)。

图2 M.bovis N和C68004 GO富集前20个差异显著蛋白Fig.2 Top 20 enriched GO terms of significantly DEPs between the M.bovis N and C68004 groups

2.4 KEGG通路分析(KEGG pathway analysis) KEGG通路分析结果如中插彩版图3A所示，RNA聚合酶通路发生了显著变化。调节这3种RNA聚合酶的基因分别是rpoA、rpoB和rpoC。M.bovisN有3种RNA聚合酶蛋白显著上调，分别为DNA介导的RNA聚合酶亚基alpha、beta和beta′(见中插彩版图3B)，这3个亚基在GO分子功能方面，属于DNA结合蛋白(见中插彩版图2)。

图3 M.bovis N和M.bovis C68004 KEGG信号通路分析Fig. 3 KEGG pathway analysis of M. bovis N and M.bovis C68004A:RNA聚合酶通路； B：RNA聚合酶蛋白结构A：RNA polymerase pathway; B:RNA polymerase protein structure

2.5 蛋白与蛋白互作网络[Protein-protein interaction (PPI)network] 蛋白质在体内不是独立存在的，它们的功能与其他蛋白质相关或受其他蛋白质调节。在PPI网络中，M.bovisN和M.bovisC68004之间的DEPs显示出高度连结性，以黄色结点表示。30S核糖体蛋白S15(UniProtKB-P66430)、50S核糖体蛋白L2(UniProtKB-A1KGI5)、30S核糖体蛋白S10(UniProtKB-P0A5X1)互作结点最高，有29个DEPs交互连接。30S核糖体蛋白S15是rRNA的主要结合蛋白之一，它直接与16S rRNA结合[11]。50S核糖体蛋白L2是30S和50S亚基结合形成70S核糖体，而30S核糖体蛋白S10参与tRNA与核糖体的结合。

2.6 平行反应验证[Parallel reaction monitoring(PRM)validation] 利用PRM验证基于TMT技术分析所得的蛋白质组学数据，采用LC-PRM/MS方法对M.bovisN和M.bovisC68004中的4个靶蛋白进行检测验证，4个DEPs分别是：A0A1R3XXR4(由lpqY基因编码)、A0A1R3Y5 J6(由ecce1基因编码)、A1KPE3(由rpoA基因编码)、A0A109S6H6(由ropB基因编码)。PRM结果显示，这4个候选蛋白与TMT数据有相似的趋势，目标蛋白的表达显著上调，这进一步支持了蛋白质组学数据的可信度和可靠性(图4)。

图4 所选DEPs相对定量与蛋白组数据匹配Fig. 4 Relative quantification of selected DEPs matched the proteomic data

3 讨论

通过TMT对2株菌株的蛋白鉴定，筛选出了一些具有显著差异和重要功能的蛋白，发现调控相应蛋白的基因，并使用PRM方法进一步验证了TMT分析数据。GO和KEGG分析发现，这些DEPs的功能包括催化、结合、运输、转录调控以及分子结构相关作用，主要参与代谢和生物过程的调节，特别是对内部或外部刺激的反应。

研究表明，结核分枝杆菌已经进化出许多逃避宿主免疫系统的途径，包括选择性抑制巨噬细胞IL-12p40的产生[12]。这一研究引起了对mmaA4基因的关注，该基因编码甲基转移酶，是分枝菌酸远端进行含氧修饰所必需的，也是参与抑制IL-12p40的关键位点[12]。突变体灭活mmaA4刺激巨噬细胞产生更多IL-12p40和TNF-α，相比野生型结核分枝杆菌毒性减弱[12]。在本试验中，与M.bovisC68004相比，mmaA4基因在M.bovisN中的表达显著上调，推测mmaA4可能是导致N株毒力增强的重要毒力因子之一(比值N/C68004=3.137 502，来自TMT结果)。同时，这个毒力因子的推测与之前N感染小鼠模型病变程度比C68004感染更为严重的研究结果相一致[2]。这为进一步研究M.bovisN的致病机制以及疫苗设计等方面提供了重要参考。

另一个重要的蛋白ecce1，属于ESX-1型分泌系统蛋白。结核分枝杆菌的致病性与ESX-1分泌系统密切相关，该系统在改变细胞信号转导、通过调节吞噬作用促进细菌逃逸、抑制吞噬溶酶体融合、影响细胞凋亡和细胞裂解等方面发挥重要作用[13]。有研究报道，ecce1是结核分枝杆菌分泌ESX-1的核心膜蛋白[14]。因此，缺乏ESX-1系统分泌蛋白使结核分枝杆菌的毒性明显降低。蛋白质学结果与PRM验证结果一致表明，ecce1在N菌中蛋白表达量显著高于C68004，这一结果说明ecce1可能是N菌毒力增强与免疫逃避的一个重要因素。但对于M.bovis这个基因的研究甚少，其对发病机制、细胞信号转导以及与巨噬细胞的相互作用等方面的作用尚不清楚。

抗结核病一线药物(如利福平)的关键耐药基因包括rpoA、rpoB和rpoC。这3个耐药基因在M.bovisN株中的表达均显著高于C68004，这意味着临床菌株N可能比C68004具有更强的耐药性。就目前情况而言，由于结核分枝杆菌耐多药菌株的出现，导致新疫苗开发进展缓慢、诊断方法有限、治疗时间延长，这使结核病的预防与治疗情况更加恶化[15]。N菌与C68004菌相比，与耐药性相关的蛋白表达明显升高，可能与动物用药增多有关。

也从侧面反映了与20世纪50年代相比，抗生素广泛用于人和动物，对细菌耐药性基因表达的影响，细菌在适应环境改变中的巨大变化和对人类健康影响的巨大挑战。

综上，通过蛋白质学的方法，初步分析出与毒力相关的致病因子和耐药性相关的基因，如mmaA4、ecce1、rpoA、rpoB和rpoC，为进一步的深入研究提供了可靠的理论基础。