吉林地区奶牛子宫内膜炎致病菌的分离鉴定及敏感药物筛选

郝景锋，李高谦，张宇航，王永生，付连军，刘立明

(1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101 ； 2. 阿勒泰职业技术学院，新疆 阿勒泰 836000 ; 3.吉林农业大学研究生学院，吉林 长春 132118)

奶牛子宫内膜炎是子宫黏膜表面及深层组织发生的炎性疾病[1]，是奶牛常见病、多发性疾病，对奶牛健康养殖危害巨大，不仅影响奶牛正常的生理功能，还会导致奶牛长期不孕，甚至造成终生不育而提早淘汰[2]，其与奶牛乳房炎、蹄叶炎并列成为制约奶牛养殖业发展的瓶颈问题。奶牛子宫内膜炎治疗产生大量费用，易产生耐药性，导致药物残留影响牛奶、牛肉等动物性食品安全[3]，我国奶牛存栏量1 440万头[4]，吉林地区奶牛养殖量较大，奶牛子宫内膜炎防控问题较为突出，本课题组拟对吉林地区多个大型奶牛场120头患病奶牛子宫内容物进行细菌分离与鉴定，并对其主要致病菌进行敏感药物筛选试验，以期为科学、合理治疗吉林地区奶牛子宫内膜炎提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验对象 患病奶牛选自吉林地区多个奶牛养殖场120头患子宫内膜炎奶牛，采用子宫内容物采样器(专利号:ZL201420335941.6)无菌采集子宫内容物。

1.2 试验器材与试剂

1.2.1 常规培养基 普通营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、绵羊血液(50 mL/L绵羊鲜血)琼脂培养基、甘露醇高盐琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、叠氮钠血培养基、营养肉汤，以上各培养基采用常规方法配制。

1.2.2 细菌鉴定生化管 生化鉴定用微量发酵管，购自上海鲁微科技有限公司。

1.2.3 药敏纸片 头孢噻呋钠、头孢噻肟、呱拉西林、庆大霉素、环丙沙星、青霉素G、氨苄西林、头孢西汀、链霉素、卡那霉素、四环素、复方新诺明、克林霉素、阿莫西林、氟哌酸、恩诺沙星、强力霉素、卡拉霉素、氧氟沙星等药敏纸片，均购自杭州微生物制剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基制备 参照《兽医微生物学》第5版[5]教材进行。

1.3.2 样品采集 奶牛子宫内膜炎患牛子宫内容物样品120份，采自吉林地区多个大型奶牛场。患牛保定后清理宿粪，以1%新洁尔灭溶液清洗外阴部[6]，采用直肠把握法向子宫内插入子宫内容物采样器采集子宫内分泌物黏液，注入无菌处理的离心管内并编号，置于冰盒中送至实验室待检。

1.3.3 细菌分离纯化培养 生理盐水稀释子宫内容物[7]，将稀释好的病料分别接种于普通营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、绵羊血液(50 mL/L绵羊鲜血)琼脂培养基、甘露醇高盐琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、叠氮钠血培养基等各种培养基内，置于37 ℃温箱内过夜，培养24 h，取出观察，根据菌落形态、是否溶血以及颜色特点分类纯培养，纯化后置于20%甘油的营养肉汤培养基于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.4 细菌鉴定 应用生化方法分类鉴定已纯化处理的待检致病菌，应用V-P、MR、触酶、凝固酶、麦芽糖氧化酶、尿素、甘露醇、葡萄糖、碱性磷酸酶、明胶液化等生化方法鉴定疑似葡萄球菌科致病菌；应用吲哚、甲基红、V-P、枸橼酸、乳糖、麦芽糖、蔗糖、尿素、间肌醇、蕈糖等生化方法鉴定疑似肠杆菌科致病菌；应用触酶、6.5%氯化钠、马尿酸钠、环腺苷-磷酸(CAMP)、甘露醇、棉子糖、山梨醇、七叶苷、乳糖、葡萄糖、水杨苷蕈糖、菊糖、淀粉等生化方法鉴定疑似链球菌属致病菌。

1.3.5 敏感药物筛选 药敏试验采用纸片琼脂扩散法[8]，选用头孢噻呋钠、庆大霉素、环丙沙星、青霉素G、氨苄西林、阿莫西林等药敏纸片，接种各已检致病菌于37 ℃温箱培养24 h后观察试验结果，测定抑菌圈平均直径，抑菌效果判定：敏感(S)、中介(I)、耐药(R)，参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的标准。

1.4 数据处理 数据结果采用5次试验的平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 样品中致病菌分离及鉴定 从120份奶牛子宫内容物样品中分离出211株细菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓链球菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌以及化脓放线菌等。结果见表1，大肠杆菌68株，占32.23%；金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌分别为26、14株，各占12.32%、6.64%；化脓链球菌49株，占23.22%；蜡样芽胞杆菌37株，占17.54%；绿脓杆菌10株，占4.74%；化脓放线菌7株，占3.32%。可见大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌以及蜡样芽胞杆菌为吉林地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌，从感染类型上来看，单一感染占44.35%；双重致病菌感染占41.74%；三重致病菌感染占13.91%。单一感染中大肠杆菌以及蜡样芽胞杆菌为主要致病菌；双重感染中大肠杆菌与化脓链球菌为主要致病菌；三重感染中大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+蜡样芽胞杆菌以及大肠杆菌+表皮葡萄球菌+ 化脓链球菌均为优势致病菌，结果见表2。

表1 吉林地区奶牛子宫内膜炎致病菌检测结果Table 1 Detection results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis in Jilin area

表2 吉林地区奶牛子宫内膜炎致病菌感染类型检测结果Table 2 Detection results of pathogenic bacteria infection types of dairy cow endometritis in Jilin area

2.2 敏感药物筛选试验 选用头孢噻呋钠、四环素以及恩诺沙星等19种药物对检测出的大肠杆菌等5种主要致病菌进行敏感药物筛选试验，结果见表3，由表3可知，各种致病菌对头孢噻呋钠、头孢噻肟、呱拉西林素、头孢西汀、链霉素以及卡那霉素均产生较强的耐药性；而四环素、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星以及氧氟沙星等对各种致病菌均有较强的抑菌作用，因此治疗吉林地区奶牛子宫内膜炎的优选药物为四环素、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星以及氧氟沙星等。

表3 不同药物对各种致病菌的平均抑菌直径Table 3 Average bacteriostatic diameter of different drugs to various pathogenic bacteria (mm)

3 讨论

本试验检测了来自吉林地区不同规模的奶牛养殖场120头奶牛，经形态学、生化鉴定分离出大肠杆菌以及蜡样芽胞杆菌等7种致病菌，共计211株致病菌，其中大肠杆菌所占32.23%，化脓链球菌所占23.22%，葡萄球菌所占18.96%，蜡样芽胞杆菌所占17.54%，感染类型中单一感染占44.35%，双重感染占41.74%。黄启震等[9]通过研究证实，赤峰、重庆、张家口以及潍坊等地奶牛子宫内膜炎的主要致病菌依次为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌以及链球菌；而宝鸡地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌为葡萄球菌；北京奶牛子宫内膜炎主要致病菌为蜡样芽孢杆菌。王京仁等[10]研究发现，常德地区奶牛子宫内膜炎致病菌病例25头患牛主要菌株的检出率依次为大肠杆菌11株(44.00%)、葡萄球菌属7株(28.00%)、链球菌5株(20.00%)。刘长彬等[11]研究证实，来自石河子垦区206份样品中分离出8种病原菌共408株，其中葡萄球菌198株(占48.53%)、链球菌109株(占25.49%)、大肠杆菌85株 (占20.83%)。赵清梅等[12]调查了宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌，研究证实单一感染与混合感染分别各占42.31%以及52.56%。以上研究均与本试验趋势一致，亦证实了奶牛子宫内膜炎的主要致病菌为大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌以及蜡样芽胞杆菌，所占比例基本一致，大肠杆菌等致病菌均为环境常见菌，证实环境因素为奶牛子宫内膜炎发生的重要因素，饲养管理水平、环境消毒能力、奶牛产科疾病治疗水平、免疫水平等因素均与奶牛子宫内膜炎发病关系密切。

辛萍萍等[13]对潍坊地区奶牛子宫内膜炎致病菌进行药敏试验证实，头孢拉定、环丙沙星、恩诺沙星抗菌效果良好，这与本试验结果十分接近。赵鑫[14]研究证实，大肠杆菌对阿莫西林、恩诺沙星、头孢噻肟敏感，葡萄球菌对阿莫西林、头孢噻肟、四环素较敏感，链球菌对阿莫西林、头孢噻肟、恩诺沙星敏感，这与本试验药物敏感趋势一致。青霉素G、头孢噻呋钠、头孢西汀、链霉素、卡那霉素以及呱拉西林这几种药物对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌以及蜡样芽胞杆菌抑菌效果均不好，可能与长期使用该药而产生的耐药性有关，也可能与季节、环境等因素有关，大量使用这些药物使机体产生抗药性，不科学的治疗会使该病治疗形成恶性循环，无法根治。而且化学药物残留严重影响乳以及肉的品质，食品安全受到前所未有的挑战，严重危害人类健康。孟彦军[15]研究证实，引起陇西县奶牛子宫内膜炎的主要致病菌大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌对氨苄青霉素、链霉素、青霉素G等药物具有耐药性，试验证实，恩诺沙星、环丙沙星以及四环素对以上致病菌抑菌效果良好，可以作为治疗首选药物。大量研究证实，抗生素在治疗奶牛子宫内膜炎中发挥了重要作用，但一定要注意耐药性问题、药物残留问题、动物性食品安全问题等，因此较为有效的方法是科学有效分离致病菌，筛选敏感药物科学治疗乃为上策。本试验成功分离出吉林地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌以及蜡样芽胞杆菌，单一感染、双重感染所占比例分别为44.35%以及41.74%，三重感染所占比例为13.91%；通过敏感药物筛选头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、四环素、阿莫西林、恩诺沙星以及氧氟沙星均显示出较好的抑菌效果，可以作为吉林地区奶牛子宫内膜炎治疗的备选药物。