慢性乙型肝炎患者Toll样受体2与乙型肝炎病毒DNA表达水平相关性研究

杨丽娟，郝小康，周 军

(1.安康市人民医院检验科，陕西 安康 725000；2.西藏民族大学附属医院检验科，陕西 咸阳 712082)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是导致慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)发生的根本性原因，也是全球性公共卫生问题[1]。我国约有HBV携带者9300万例，其中CHB患者2000万例，是肝硬化、肝功能失代偿、肝癌发生的主要危险因素，早期诊治可及时阻断病情，改善患者预后[2-3]。特别是很多CHB患者机体免疫功能低下，不能产生有效的针对HBV的特异性细胞毒T淋巴细胞反应，使HBV得以不断复制增殖，导致HBV感染持续化，形成恶性循环[4-5]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是在机体免疫性发挥重要作用的一类模式识别受体(PRR)家族分子，具有高度保守的分子结构，可被非特异性免疫细胞识别[6-7]。在病毒性肝炎中，TLRs与配体结合后可经胞内信号转导途径激活核转录因子的表达，诱导特异性靶细胞基因的表达，从而抑制机体的病毒复制，介导修复机体的肝损伤[8-10]。本研究探讨CHB患者HBV-DNA水平与TLR2表达的相关性，以明确CHB发生机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年8月到2020年10月在本院诊治的CHB患者123例作为肝炎组，选择同期的健康体检者123例作为对照组。两组一般资料对比无统计学差异(均P>0.05)，见表1。肝炎组纳入标准：均符合CHB诊断标准，病程≥6个月；HBV-DNA检测阳性；年龄25～75岁；患者均知情同意并签署同意书。排除标准：妊娠与哺乳期妇女；药物、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎及其他病毒性肝炎感染者；不能合作者；临床资料缺乏者；严重心、肺、脑、肾等重要脏器功能障碍者。

表1 两组一般资料对比

1.2 HBV-DNA水平与TLR2相对表达检测 抽取所有入选者空腹静脉血2～3 ml，肝素钠抗凝30 min，3000 r/min离心15 min。取全血组织提取淋巴细胞，分离单个核细胞。提取总RNA后逆转录为cDNA，进行荧光定量PCR扩增，PCR条件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20s持续40个循环，40 ℃ 10 s。TLR2正向引物为5’-GGGAACATCCAAGGCAAG-3’，反向引物为5’-AGCTCATCTAGCACCTCACT-3’。同时检测HBV-DNA水平。

1.3 肝功能指标检测与病理分级 调查所有入选者一般资料，记录肝功能指标[谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)等]水平。对肝炎组患者进行肝脏炎症病理分级：①汇管区及周围无炎症，小叶内无炎症，为G0级；②汇管区及周围炎症，小叶内变性及少数点状坏死，为G1级；③汇管区及周围轻度碎屑样坏死，小叶内可见嗜酸小体，为G2级；④汇管区及周围中度碎屑样坏死，小叶内可见变性、融合坏死，为G3级；⑤汇管区及周围重度碎屑样坏死，累及多小叶坏死，为G4级。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.00统计学软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，对比采用t检验。计数资料对比采用卡方检验。相关性分析应用Pearson法。影响CHB患者HBV-DNA水平的因素采用Logistic回归分析。P<0.05认为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 两组HBV-DNA与TLR2相对表达水平比较 对照组未检出HBV-DNA，肝炎组HBV-DNA<103IU/ml 45例，103～106IU/ml 55例，>106IU/ml 23例。肝炎组TLR2相对表达水平高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组TLR2相对表达水平比较

2.2 肝炎组患者炎症病理分级 在肝炎组炎症病理分级中，G0级56例，G1级24例，G2级20例，G3级13例，G4级10例。

2.3 两组常规肝功能指标比较 见表3。肝炎组血清ALT、AST、AFP、GGT与ALP高于对照组(均P<0.05)。

表3 两组常规肝功能指标比较

2.4 CHB患者HBV-DNA与TLR2等指标相关性分析 见表4。Pearson相关性分析结果显示，HBV-DNA水平与TLR2、ALT、AST、AFP、肝脏炎症病理分级、ALP存在相关性(均P<0.05)。

表4 CHB患者HBV-DNA与TLR2等指标相关性

2.5 CHB患者HBV-DNA水平影响因素分析 见表5。在123例患者中，以HBV-DNA水平作为因变量，以TLR2、ALT、AST、AFP、肝脏炎症病理分级作为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示TLR2、ALT、AST、AFP、肝脏炎症病理分级均为CHB患者HBV-DNA水平的影响因素(均P<0.05)。

表5 CHB患者HBV-DNA水平影响因素分析

3 讨 论

CHB为临床上比较常见的传染性疾病，是肝细胞癌、肝硬化、肝功能失代偿发生的重要病因[11]。其具体发生机制，目前还不明确，一些学者认为宿主免疫系统与HBV-DNA相互作用是重要原因，特别是体内HBV-DNA的感染与清除以及相关肝脏损伤情况往往取决于机体的免疫状态[12-13]。本研究显示对照组未检出HBV-DNA，肝炎组均检出HBV-DNA，且肝炎组TLR2相对表达水平也高于对照组。TLR在触发先天免疫抗病毒过程中起关键作用，HBV-DNA反过来也可以通过抑制TLR等激活而抑制宿主防御，抵抗机体对病毒的清除[14]。TLR2属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区组成[15]。胞质区为Toll/白细胞介素-1受体(TIR)结构域，跨膜区是富含半胱氨酸的区域，胞外区是由串联的富含亮氨酸的重复基序形成的亮氨酸结构域[16]。胞质区与白介素-1受体家族高度同源，负责与细胞内含有TIR结构域的接头蛋白分子相互作用，调节下游信号级联反应[17]。TLR2主要分布于细胞膜上，可以识别胞质中的双链RNA(dsRNA)，再通过衔接蛋白启动特异性信号通路，从而激活促炎症细胞因子基因，介导抗病毒效应。相关研究显示，巨噬细胞上TLR2下游通路可以被HBV-DNA干扰，导致炎症因子分泌受到抑制，从而使抗病毒免疫能力受到影响。TLR2不仅在肝炎和肝纤维化时表达水平升高，而且在肝癌组织中也有持续表达[18]。下调或沉默TLR2则可明显降低化学诱导肝炎的发生率，上调TLR2可促进相关炎症因子等的释放[19]。

CHB的发生是一个复杂过程，涉及许多肿瘤标志物与基因在不同节点的表达[20]。本研究显示肝炎组血清ALT、AST、AFP、GGT与ALP值高于对照组，不过这些指标的特异性不强，很难单独反映CHB病情进展情况，为此在临床上还需要寻找能够完全满足临床诊断的可靠标记物。

细胞免疫应答(包括辅助T细胞和细胞毒T细胞应答)在机体清除HBV-DNA过程中起重要作用[21]。TLR2能识别dsRNA，活化MyD88非依赖信号通路，激活促炎症因子及Ⅰ型干扰素基因转录，介导抗病毒效应[22]。本研究Pearson相关性分析显示CHB患者HBV-DNA水平与TLR2、ALT、AST、AFP、肝脏炎症病理分级、ALP均存在相关性；Logistic回归分析显示TLR2、ALT、AST、AFP、肝脏炎症病理分级均为CHB患者HBV-DNA水平的影响因素。TLR2可调控先天和获得性免疫，在HBV感染及继发肝脏炎症损伤过程中起着至关重要的作用。

综上所述，CHB患者多伴有TLR2高表达，与HBV-DNA水平呈正相关，是影响CHB患者病情与肝功能的重要指标。但限于患者数量少及收集时间较短等原因，本研究可能存在一定偏倚，后续将进行更为深入的研究。