响应面法优化黄花鱼鱼鳞脱钙工艺

李文凤,王标诗,余石坚,陈舒琪,杨胜远,胡小军,彭元怀,江 敏,马景球

(岭南师范学院食品科学与工程学院,广东湛江 524048)

我国渔业经济结构与生产规模越来越大,但在渔业供求链不断提高的同时会产生大量的下脚料废弃物,其中包含大量的鱼鳞,其对环境净化造成一定的压力[1-2]。经研究分析鱼鳞中的成份主要为生物性高分子胶原蛋白和羟基磷灰石,越来越多的学者以鱼鳞为原料提取胶原蛋白,进而开发药用明胶产品，这拓展了其在保健食品、医药和化妆美容等方向的应用，是近年来的研究热潮[3-5]。吴凌涛等[6]对十种淡水鱼进行研究分析,得出鲈鱼和黄花鱼营养价值较高的结论。而黄花鱼作为我国四大海洋渔业品种之一,生长分布广泛,具有很好的食疗作用,长期以来深受消费者的喜欢[7-8]。黄花鱼除鲜食外,还可加工成鱼罐头、鱼糜等系列产品,在鲜食和加工过程中鱼鳞一般被制成饲料或作为废弃物进行处理,鱼鳞中含有丰富的胶原蛋白,对黄花鱼鱼鳞进行合理研究利用,能提高鱼类加工副产物的附加值,进一步增大其经济效益。

鱼鳞是由三螺旋结构的胶原蛋白和羟基磷灰石共同形成的纤维板层结构,其中胶原被磷灰石黏附,因此提取鱼鳞胶原蛋白之前,鱼鳞必须脱灰脱钙,而且脱钙越彻底,胶原蛋白的质量越高[9]。据目前研究,有关鱼鳞脱钙工艺的研究方法主要有酸法(盐酸、柠檬酸、乳酸等)、热水提取法和EDTA法,以及其他物理辅助脱钙法(超声波、微波、磁力搅拌等)[10]。蒋柏泉等[11]在单因素基础上建立动力学方程,以盐酸为脱钙剂得到最优工艺条件下鳙鱼鱼鳞脱钙率为86.20%。彭元怀等[12]以柠檬酸为脱钙剂对罗非鱼鱼鳞进行脱钙,运用EDTA 络合滴定法在单因素基础上利用正交设计进行实验优化分析,脱钙率达96.13%。王梅英等[13]通过采用二次通用旋转组合设计进行超声波辅助罗非鱼鱼鳞盐酸脱钙的优化试验,在最优工艺条件下脱钙率达到92.43%。可见,不同的方法对鱼鳞脱钙效果有一定差异。

对于鱼鳞脱钙工艺的研究,淡水鱼中罗非鱼[12-13]和四大家鱼(青鱼草鱼鲢鱼和鳙鱼)[14-17]都有相关研究报道,海水鱼中(如沙丁鱼[18])也有部分报道,尚未见对黄花鱼鱼鳞脱钙的相关报道,而物理场辅助酸法对鱼鳞脱钙相关的报道也较少。使用的脱钙剂多为柠檬酸和盐酸,考虑到安全性和成本等因素,本试验以柠檬酸为脱钙剂,利用超声波对液体产生的空化作用而使液体瞬间获得巨大压力来改变鱼鳞脱钙效果,考查料液比、柠檬酸浓度、超声时间这三因素对黄花鱼鱼鳞脱钙率的影响,并通过响应面Box-Behnken试验原理对鱼鳞脱钙进行优化分析,以期为黄花鱼鱼鳞胶原蛋白的提取提供参考条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄花鱼鱼鳞 收集于湛江市东风市场;碳酸钙、盐酸、氨水、氯化铵、铬黑T、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、氢氧化钠、无水乙酸钠等 均为分析纯。

FA2104N-电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司;PHS-3C精密酸度计 上海精研电子科技有限公司;BAO-50A精密鼓风干燥箱 施都凯仪器设备(上海)有限公司;JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;HZS-HA水浴振荡器 广州市德科生物科技有限公司;210 mm干燥器 台州市伟新粮检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼鳞脱钙工艺 将收集的鱼鳞用清水多次冲洗并去除杂质,于35 ℃干燥箱鼓风干燥24 h后储存于干燥器备用;将干燥的鱼鳞剪成细小碎片,称取一定量加入一定体积和浓度的柠檬酸溶液,在超声波功率为450 W条件下处理一定时间后,过滤、取滤液备用。

1.2.2 单因素实验设计 在超声波功率为450 W条件下,以脱钙率为指标,固定柠檬酸浓度为10%,超声时间为60 min,探究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对鱼鳞脱钙的影响;固定液料比为1∶20 (g/mL),超声时间为60 min,探究柠檬酸浓度(6%、8%、10%、12%、14%)对鱼鳞脱钙的影响;固定液料比为1∶20 (g/mL),柠檬酸浓度为10%,探究超声时间(30、45、60、75、90 min),此时间为实际超声总时间,不包括间歇时间,操作中每超声工作2 s,间歇2 s)对鱼鳞脱钙的影响。

1.2.3 响应面试验设计 在单因素实验基础上,以料液比(X1)、柠檬酸浓度(X2)、超声时间(X3)这3个因素为自变量,脱钙率(Y)为响应值,采用响应面中Box-Behnken试验原理进行三因素三水平试验。因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 脱钙率的测定

1.2.4.1 鱼鳞中总钙含量的测定 按照GB 5009.92-2016食品安全国家标准 食品中钙的测定,具体操作如下。将晾干的鱼鳞剪碎准确称取一定量,按照1∶20的料液比加入1 mol/L的盐酸溶液,在室温下进行处理24 h后将液体转移至100 mL容量瓶并定容,用EDTA(0.001 mol/L)溶液进行滴定。试样的总钙含量按下式计算:

式中,X-样液中的总钙含量,mg/kg;T-EDTA-2Na滴定度,mg/mL;V1-滴定样液时所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的体积,mL;V0-滴定空白液时所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的体积,mL;V2-样液总体积,mL;m-试样质量,g;V3-滴定用样液的体积,mL;1000—换算系数。

1.2.4.2 钙离子标准曲线的绘制 参考肖莉等[14]实验方法。准确称取经干燥处理的基准碳酸钙2.5000 g于250 mL烧杯中,缓慢加入少量的盐酸(6 mol/L)进行溶解,定容于1000 mL容量瓶。准确吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mL脱钙液于250 mL锥形瓶中,加蒸馏水至50 mL,依次加入15 mL氨水缓冲液,3滴铬黑T,摇匀后用0.01 mol/L的EDTA-2Na标准溶液滴至溶液变为蓝色,记录消耗EDTA-2Na的体积。分别以EDTA-2Na的消耗体积和钙离子浓度为横纵坐标绘制钙离子标准曲线,得到该曲线的线性回归方程。

1.2.4.3 脱钙率的计算 取1 mL脱钙后的滤液与锥形瓶中。按照1.2.4.2的操作进行滴定得到反应消耗EDTA-2Na的体积,并通过1.2.4.2得到的线性回归方程计算钙离子浓度,按下式计算脱钙率:

式中,Y-鱼鳞脱钙率,%;ρ-由标准曲线得到的钙离子浓度,mg/mL;V-柠檬酸体积,mL;F-滴定时稀释倍数;m-黄花鱼鱼鳞质量,g;H-鱼鳞总钙含量,mg/kg。

1.2.5 鱼鳞胶原蛋白损失率测定 羟脯氨酸是胶原蛋白的氨基酸组成之一,其与胶原蛋白的含量成正相关关系,故通过测定羟脯氨酸含量可间接计算出胶原蛋白的损失率值[19-20]。参照国标GB/T 9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》的方法,分别测得脱钙液中的羟脯氨酸含量N和鱼鳞中羟脯氨酸含量M,再按照以下公式进行黄花鱼鱼鳞脱钙后胶原蛋白的损失率Y(%)计算:

式中,Y-胶原蛋白损失率,%;N-羟脯氨酸含量,%;M-鱼鳞中羟脯氨酸含量,%。

1.3 数据处理

所有的试验至少进行三次,根据三次试验结果计算相应的标准偏差。结果以均值或均值(标准偏差的形式表示。应用Excel软件进行绘图,Design-Expert V8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 钙离子标准曲线

钙离子标准曲线见图1。根据钙离子标准曲线得出回归方程为:y=0.0198x-0.0007,式中y为钙离子浓度,mg/mL;x为EDTA-2Na消耗体积,mL;决定系数R2为0.9999,表明EDTA-2Na消耗体积和钙离子浓度有良好线性关系。

图1 钙离子标准曲线Fig.1 Calcium ion standard curve

2.2 羟脯氨酸标准曲线

羟脯氨酸标准曲线见图2,以吸光度(扣除空白)为纵坐标、羟脯氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据测定结果计算回归方程为 y=0.2068x+0.0076,决定系数R2为0.9994,显示吸光度与羟脯氨酸浓度有良好的线性关系。

图2 羟脯氨酸标准曲线Fig.2 Standard cuve of Hyp

图3 料液比对黄花鱼鱼鳞脱钙的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3 单因素实验结果

2.3.1 料液比对鱼鳞脱钙的影响 料液比对黄花鱼鱼鳞脱钙的影响结果见图3。由图3可以看出,料液比小于1∶20时,随着料液比的增加鱼鳞脱钙率明显升高,可能是溶液体积增大,使得鱼鳞更加分散,增大了柠檬酸与羟基磷灰石的接触表面积,从而促进脱钙。当料液比超过1∶20后,进一步增加料液比,脱钙率有降低的趋势,可能鱼鳞中钙离子对柠檬酸的需求基本达到饱和状态[15],再增加料液比,反而不利于鱼鳞脱钙。因此选取液料比为1∶20 g/mL较合适。

2.3.2 柠檬酸浓度对鱼鳞脱钙的影响 柠檬酸浓度对黄花鱼鱼鳞脱钙的影响结果见图4。由图4可以看出,脱钙率随着柠檬酸浓度的增高有先升后降的趋势,在浓度为10%时有较高脱钙率,相比浓度为6%时的脱钙率,两者结果相差9.32%,说明柠檬酸浓度对脱钙率有较大影响,在浓度较低时,提高反应物的浓度,有利于钙离子与柠檬酸反应生成柠檬酸钙,进而促进脱钙。在柠檬酸浓度达到10%时,此时体系中的柠檬酸已经能够满足钙离子的反应需求,体系已趋于平衡[15],此时提高柠檬酸浓度,对脱钙反而不利从而降低了鱼鳞脱钙率。因此选取柠檬酸浓度为10%较适。

图4 柠檬酸浓度对黄花鱼鱼鳞脱钙的影响Fig.4 Effect of citric acid concentration on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3.3 超声时间对鱼鳞脱钙的影响 超声时间对黄花鱼鱼鳞脱钙影响的结果见图5。由图5可以看出,超声时间小于60 min时,脱钙率随着时间的变化明显升高,说明鱼鳞中的钙溶出到与柠檬酸反应需要一定时间;当脱钙时间超过60 min 后,进一步提高反应时间,而脱钙率反而降低,说明过长时间超声处理反而不利于鱼鳞脱钙。因此选取超声时间为60 min较适。

图5 超声时间对黄花鱼鱼鳞脱钙的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on decalcification rate of yellow croaker scales

2.4 响应面试验

2.4.1 模型的建立与分析 以料液比(X1)、柠檬酸浓度(X2)和超声时间(X3)为试验因素,鱼鳞脱钙率Y(%)为评价指标,运用Design-Expert V8.0.6 Box-behnken进行响应面设计,其试验设计及结果见表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Experimental design and results

对表2进行回归分析得到试验因素与脱钙率的方程式如下:

对上述回归模型进行方差分析和回归系数的显著性检验,结果见表3。由表3中方差分析可知,回归模型的失拟项P=0.0640>0.05,说明该模型计算不存在显著误差,所得方程与实际拟合良好;模型的复决定系数R2值为0.9927,拟合度>90%,表明该模型与实验拟合程度较好,能合理描述响应值的变化过程。因此可利用该模型对黄花鱼鱼鳞脱钙提取率进行分析和预测。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验Table 3 Variance analysis and their significance test of its coefficients for the regression model

图6 柠檬酸浓度与超声时间对脱钙率影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and ultrasonic time on decalcification rate

图7 柠檬酸浓度和料液比对脱钙率影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and solid-liquid ratio on decalcification rate

图8 超声时间和料液比对脱钙率影响的响应面和等高线图Fig.8 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on decalcification rate

2.4.2 响应曲面图型分析 图6是料液比为1∶20的条件下辅以450 W功率的超声波进行鱼鳞脱钙,柠檬酸浓度-超声时间与鱼鳞脱钙率关系的响应曲面图和等高线图。从图6可知,当超声时间为60 min以下某一固定值,柠檬酸浓度在6%～10%范围时,脱钙率随柠檬酸浓度增高而增高;当超声时间为60 min以上某一固定值,柠檬酸浓度在10%～14%范围时,脱钙率随柠檬酸浓度增高而降低。通过检验结果P=0.2087(P>0.05),显示柠檬酸浓度与超声时间的交互作用对鱼鳞脱钙率的影响不显著。

图7是超声时间为60 min的条件下辅以450 W功率的超声波进行鱼鳞脱钙,柠檬酸浓度-料液比与鱼鳞脱钙率关系的响应曲面图和等高线图。从中可知,在柠檬酸浓度为8%～12%,料液比为1∶15～1∶25区间时,脱钙率有最大阈。P=0.6264(P>0.05),显示柠檬酸浓度与料液比的交互作用对鱼鳞脱钙率的影响不显著。

图8是柠檬酸浓度为10%的条件下辅以450 W功率的超声波进行鱼鳞脱钙,超声时间-料液比与鱼鳞脱钙率关系的响应曲面图和等高线图。从中可知,超声时间较短时,适当增大料液比能提高脱钙率;超声时间较长时,过大的料液比比值反而降低脱钙率。通过检验结果P=0.1349(P>0.05),显示超声时间与料液比的交互作用对鱼鳞脱钙率的影响不显著。响应面模型中的曲面投影形状可以反映出考查因素间交互效应的强弱,图形的形状近似圆形能体现出各个因素之间的交互作用不是很显著[21]。图7和图8等高线更接近于圆形,也说明其交互作用不显著。

2.4.3 提取条件的优化与验证 经过实验统计软件Design-Expert. V8.0.6对数据进行分析拟合,得到黄花鱼鱼鳞脱钙最优工艺条件:料液比为1∶19.28,柠檬酸浓度为10.55%,超声时间为65.56 min,响应面模型预测的脱钙率为99.33%。结合实验室实际情况及方案实施的可操作性,对上述工艺条件进行调整为:料液比1∶19,柠檬酸浓度10.5%,超声时间为65 min,以此条件在功率为450 W的超声下进行三次平行试验测得实际脱钙率为99.18%±0.14%,说明该方程与实际情况拟合良好,实际值与预测值的误差约为0.15%,误差较小,可能是由于条件差异导致。此数据也高于试验中的最高值99.02%,因而说明运用响应面法优化黄花鱼鱼鳞脱钙工艺的方法相对较为合理,得到拟合方程适用于对黄花鱼鱼鳞脱钙工艺条件进行参数优化和分析。

2.4.4 最优条件下鱼鳞脱钙胶原蛋白的损失率结果 在最优条件工艺下对鱼鳞脱钙液测定胶原蛋白含量,进行三次平行试验,最终得到胶原蛋白损失率为4.08%±0.36%,胶原蛋白损失不大。因此表明超声波辅助柠檬酸对黄花鱼鱼鳞的胶原蛋白影响较小,可以对鱼鳞中钙进行有效脱除能进行工艺优化,这将为黄花鱼鱼鳞进行下一步提取胶原蛋白的研究提供很好的基础。

3 结论

通过响应面法设计建立了鱼鳞脱钙的液料比、柠檬酸浓度和超声时间三因素的回归模型,表明该模型与实验拟合程度较好,可利用该模型对黄花鱼鱼鳞脱钙提取率进行分析和预测。三个自变量对鱼鳞脱钙率的影响大小的结果依次为:超声时间>料液比>柠檬酸浓度。通过优化分析得出黄花鱼鱼鳞最佳脱钙工艺条件为:在超声波功率450 W下,料液比为1∶19,柠檬酸浓度为10.5%,超声时间为65 min,在此条件下鱼鳞脱钙率高为99.18%±0.46%,胶原蛋白损失率为4.08%±0.36%,说明超声波辅助可以有效提高柠檬酸对黄花鱼鱼鳞脱钙效果,而且对鱼鳞胶原蛋白的损失极小,这为后续提取鱼鳞胶原蛋白奠定了好的基础。