成都市生鲜猪肉MRSA分离株的流行特征分析

屈 云,贺苏皖,赵燕英,施春雷,陈 娟,于基成,唐俊妮,*

(1.西南民族大学食品科学与技术学院,青藏高原动物遗传资源保护 与利用教育部重点实验室,四川成都 610041; 2.上海交通大学农业与生物学院中美食品安全联合研究中心,上海 200240; 3.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室,沈阳大连 116600)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是社区和医院临床感染最为常见的病原体之一,也是污染食品引发食物中毒的主要致病菌。该类菌株能分泌一系列酶如核酸酶、透明质酸酶等,这些酶能将局部宿主组织转变成细菌生长的营养成分[1]。一些菌株还能产生多种毒性蛋白,包括肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)、休克综合征1型毒素(toxic shock syndrom toxin-1,TSST)、剥脱毒素(exfoliatin,ET)、溶血素(hemolysin,HL)和杀白细胞素(panton-valentine leucocidin,PVL)等,可引起急性金黄色葡萄球菌毒血症和食物中毒[2-3]。尤其是携带编码青霉素结合蛋白基因mecA的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA),表现出对多种抗生素耐药。因此,金黄色葡萄球菌感染给临床治疗带来困难,特别是MRSA感染,成为世界范围内较难治疗的感染性疾病之一[4]。目前,MRSA菌株在世界各地的医院、社区、养殖场,动物性食品中广泛流行,成为备受关注的“超级细菌”[5]。要弄清楚MRSA的传播特征,分子分型技术非常重要。葡萄球菌染色体基因盒mec(Staphylococcal Cassette Chromosomemec,SCCmec)分型、葡萄球菌A蛋白(spa)分型和多位点序列(Multilocus sequence typing,MLST)分型作为研究MRSA在人-畜-食品传播途径的重要依据,是MRSA流行病学调查研究的重要工具[3]。来自家畜及其相关衍生食品中MRSA的检出被不断报道,屠宰携带MRSA的动物以及感染MRSA的人员处理食品时都可能会造成食物的污染,对人类健康造成巨大威胁[6-7]。所以针对畜禽肉中MRSA的污染调查非常必要。本文主要针对成都市生鲜猪肉样品中分离出的MRSA菌株进行流行特征分析,为成都市MRSA的传播途径研究及防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2×TSINGKE Master Mix、核酸染料GELVIEW、DL2000 Marker 擎科梓熙生物技术有限公司;无水乙醇 成都海兴化学试剂厂;1×TE缓冲液;1×TAE缓冲液、甘油 天津市瑞金特化学品有限公司;Tris饱和酚 北京博奥拓达科技有限公司;1%亚碲酸钾卵黄增菌液、Baird-Parker琼脂培养基、Muller-Hinton(MHA)琼脂培养基、胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基、Muller-Hinton Borth(MHB)培养基、7.5%氯化钠肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基 青岛海博生物技术有限公司;G-10电泳凝胶琼脂糖 Biowest公司;氢氧化钠、氯化钠(分析纯) 福晨化学试剂有限公司;抗生素药敏片 Oxoid公司。

DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂;5804R型Eppendorf 冷冻离心机 Eppendorf中国有限公司;WD800B型微波炉 顺德市格兰仕微波炉电器有限公司;PTC-200PCR仪、UniversalHood Ⅱ型凝胶成像仪 Bio-Rad公司;SW-CJ-2FD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;MLS-3020 电热自动灭菌锅 日本SANYO公司;UV-6100分光光度计 上海美普达仪器有限公司;GHP-9080水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HZQ-F160 恒温振荡培养箱 江苏省太仓市实验设备厂;AKHL-Ⅲ-24艾柯超纯水机 成都康宁实验专用纯水设备。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株来源及鉴定 2017年秋～2018年夏,按照随机抽样法分别从四川省成都市七个行政区食品市场采集生鲜猪肉样品若干份,依照《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(GB 4789.10-2010)[8]分离鉴定出金黄色葡萄球菌共计297株(由本实验室保存)。采用文献报道的酚-氯仿-异戊醇法提取细菌DNA[9]。以编码青霉素结合蛋白的基因mecA作为MRSA的判定,并以携带该基因的MRSA ATCC43300为参考菌株,采用mecA基因引物对分离菌株进行PCR鉴定[10]。引物序列如下:mecA-F:5′-TGGCTCAGGTACTGCTATCC-3′;mecA-R:5′-CACCTTGTCCGTAACCTGAA-3′。

PCR反应体系:2×TSINGKE Master mix 10 μL;上下游引物各0.4 μL;DNA 模板1 μL;ddH2O 8.2 μL;共20 μL体积,理论片段长度556 bp。

PCR反应程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性20 s;56 ℃退火10 s;72 ℃延伸30 s;共35个循环,72 ℃延伸2 min。将PCR扩增阳性结果送至上海生工有限公司进行测序,测序结果使用clustalx183软件进行多序列比对,并采用MEGA V7.0.26软件构建进化树。

表1 SCCmec分型引物序列Table 1 SCCmec typing primer sequence

1.2.2 SCCmec、spa及MLST分型 SCCmec分型是根据SCCmec染色体盒中不同组成元件的复杂排列顺序来进行分型[11],MLST联合SCCmec分型方法最初由Enright等[12]建立,该分型方法能够将MRSA克隆株、遗传背景和进化有机地结合起来[13]。另外,编码葡萄球菌蛋白A的spa基因的X区域具有良好的稳定和重复性,spa分型也被广泛用于研究不同地区金黄色葡萄球菌的爆发流行[14]。因此,本研究采用以上三种分型方法对MRSA菌株进行分型探究。

1.2.2.1 SCCmec分型 MRSA菌株SCCmec分型引物序列及扩增条件见参考文献[15],DNA模板制备同上,PCR体系同1.2.1。对阳性扩增产物进行测序比对。

1.2.2.2spa基因分型 引物序列:spa-F:5′-TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C-3′;spa-R:5′-CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT-3′[16]。DNA模板制备同上,PCR体系同1.2.1,产物进行测序分析,测序结果使用DNAMAN软件进行比对拼接分析,从而得到菌株的spa基因分型。

1.2.2.3 MLST分型 多位点序列分型(Multiple-locus sequence typing,MLST)通过直接测定MRSA的7个管家基因(aroE、arcC、gmk、pta、glpF、tpi和yqiL)的核苷酸序列进行。引物序列及反应条件见表2,DNA模板制备与PCR体系配制同1.2.1。扩增产物进行1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳处理,将结果进行双向测序并拼接。用每个菌株的7个拼接片段在MLST数据库中进行搜索配对,得到7个管家基因相对应的基因编号,再进行匹配得到菌株对应的ST编号。

表2 MLST分型引物序列Table 2 MLST typing primer sequences

1.2.3 MRSA携带相关特征基因的检测 针对肠毒素基因[17-18]、其他毒力基因[12,19-20]、耐抗菌药物基因[21-25]、耐消毒剂基因[26]及生物被膜形成相关基因[27]的检测,按照文献报道的引物序列,进行引物的合成和PCR扩增。细菌DNA模板的制备方法同上,PCR体系同1.2.1。产物进行1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳,并对阳性扩增产物进行测序确认。

1.2.4 抗生素敏感性实验 采用金黄色葡萄球菌ATCC6538为药敏实验阳性对照,根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards in stitute,CLSI[28])推荐的K-B纸片扩散法进行操作,实验结果按照CLSI的标准进行判定。所用抗菌药物及浓度见表3。

表3 22种抗生素药物及其使用浓度Table 3 22 antibiotics and their concentration in this study

1.3 数据处理

数据采用Microsoft Excel、SPSS 22.0软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 猪肉源MRSA菌株的鉴定

PCR结果显示,从297株生鲜猪肉源金黄色葡萄球菌中,检测出携带mecA基因的菌株有24株(图1A),MRSA的分离率为8.08%(24/297)。进一步对24份阳性扩增产物进行测序比对,并采用DNAMAN软件构建系统发育树,结果显示:24株MRSA分离株与NCBI网站上报告的参考菌株mecA基因具有高度同源性(图1B)。

图1 mecA基因检测PCR电泳图(A) 和mecA基因测序比对结果(B)Fig.1 The PCR electrophoresisof mecA gene(A) and the result of mecA gene sequencing comparison(B)注:图A泳道1～24:MRSA分离菌株1～24; 泳道M:DL2000Marker;泳道N:阴性对照;泳道P: 阳性对照,以MRSA参考菌株ATCC43300为阳性对照。

2.2 MRSA的分型结果

根据三种分型方法的分析结果表明:24株猪肉源MRSA分离菌株的主要MLST类型为:ST88(50%)、ST59(16.67%)和ST9(16.67%),另外,4株未鉴定出MLST型别;spa分型结果包括12株T1376、6株T437、3株T3433、以及T2310、T899、T3515各1株;分离株SCCmec分型主要集中于SCCmecIva和SCCmecIVb型,其中,还发现SCCmecV及SCCmecIII各1株,4株未鉴定出SCCmec型别。具体的分型分析结果见表4。

表4 MRSA菌株分型结果Table 4 MRSA strains typing results

2.3 MRSA菌株的药敏结果以及携带相关特征基因的检测结果

24株猪肉源MRSA菌株药敏试验结果表明:不同菌株间存在差异,除MRSA14和MRSA20外,其余的22株菌株(91.67%,22/24)具有多重耐药性(3～11)。所有菌株都对青霉素G和氨苄西林表达出抗性,对其他抗生素如四环素、红霉素、头孢西丁等也存在不同程度的耐药现象,具体见表5。

MRSA菌株耐抗菌药物相关基因的检测结果表明:24株MRSA中,氟喹诺酮类耐药基因阳性检出率较高norA、grlA检出率分别为100.00%(24/24)和75.00%(18/24);其次为氨基糖苷类(aac6′/aph2′),携带率为75.00%(18/24);大环内脂类(ermB,ermC)阳性检出率分别为62.50%(15/24)、54.17%(13/24)。此外,氯霉素类(chlA)也有部分检出,携带率为33.33%(8/24)。PCR检测结果显示:62.5%(15/24)的菌株携带耐消毒剂基因。其中,qacG基因携带率为50.00%(12/24);qacC基因携带率为20.83%(5/24);qacA/B和qacH的阳性检出率均为4.17%(1/24)。其中,MRSA17菌株同时携带三种耐消毒剂基因(qacA/B+qacC+qacG)。

针对肠毒素基因的检测结果表明:24株MRSA菌株中共13种肠毒素基因被检出。其中,携带完整的egc肠毒素基因簇(seg,seu,sei,sem,seo,sen)的菌株有两株(MRSA8和MRSA13);33.33%(8/24)的菌株携带有传统肠毒素A～E基因(sea～see);79.17%(19/24)的菌株携带溶血素基因(hla或hlb),其中,8株同时携带两种溶血素基因(hla+hlb)。

针对生物被膜形成相关基因的检测结果表明:共10种生物被膜形成相关基因被检出,每株菌株生物被膜形成相关基因的携带情况在5～10种之间。其中clfB、eno、icaBC、ebps和sasG在24株MRSA中的检出率为100%;fib和icaAD检出率均为95.83%(23/24);sasC(18/24,75.00%);cna(8/24,33.33%)和fnbA(3/24,12.5%)。具体检测结果详见表5。

表5 MRSA菌株耐药表型和毒力基因分布Table 5 The drug resistance phenotype and virulent genes distribution of 24 MRSA strains

3 讨论

本研究从成都市七个行政区的不同市场采集生鲜猪肉样本,一共分离得到24株MRSA菌株。MLST分型结果显示成都市猪肉源MRSA菌株主要以ST9、ST59和ST88型为主;SCCmec分型主要为SCCmecIva和SCCmecIVb;spa分型以t437、t1376 和t3433 为主要类型。可见,ST59-t437-IVa、ST9-t3433-IVb和ST88-t1376-IVa为成都市猪肉源MRSA的主要流行克隆株。

本研究中,MRSA的分离率为8.08%,这一结果对比学者之前对广东、河南和上海猪源MRSA的检出率3.6%～33.2%[29-33],说明各地区猪源MRSA的流行存在地域差异。为了区分MRSA的流行源头,学者们将MRSA菌株分为:医院相关的MRSA(HA-MRSA)、社区相关的MRSA(CA-MRSA)和与家畜相关的MRSA(LA-MRSA)[34]。2005年以前,虽然在牛及宠物上分离获得少量LA-MRSA,但未引起重视。直到发现LA-MRSA通过环境或食物链向人传播才引起广泛关注[35]。近年来LA-MRSA感染人的病例报道不断在全球范围内出现,人们逐渐意识到它是一类重要的人畜共患病原菌。亚洲地区对LA-MRSA的报道主要集中在中国、日本、韩国等。LA-MRSA一般主要以欧洲国家的ST398和亚洲的ST9 流行菌株为主[36]。中国的ST9优势菌株被鉴定为t899-SCCmecIII和t899-SCCmecIVb或V,以及台湾的t899-untyped SCCmec[37]。Wagenaar等[38]曾在四川省等部分猪场圈舍尘土中分离到MRSA,优势克隆菌株也为 ST9,并存在变异体 ST1376。结合Wang等[39]和李君[40]的研究进一步表明ST9-t899是我国猪源相关的MRSA主要流行型别。本研究中也检出了4株ST9型MRSA菌株,同时也检出了12株ST88和3株ST59型,ST88常被描述为非洲相关流行克隆株[41-42],这说明成都市猪源MRSA菌株分布类型可能在发生变化,且以ST9、ST88和ST59克隆型传播。本次研究中分离出的ST88菌株几乎都存在多重耐药情况,这一结果与其他学者研究发现ST88 对β-内酰胺类、红霉素、克林霉素等具有较强的抗性的结果相一致[43-44]。Sun等[44]的报道的一株ST88谱系的CA-MRSA菌株携带基因组岛νSaα、νSaβ、νSaγ和ΦSa3,以及携带编码中毒性休克综合征毒素的基因致病岛νSa2,超抗原肠毒素SEC和SEL,说明ST88谱系的MRSA具有很强的毒力系统,应加以重视。张强等[45]对来源于陕西的12株猪源MRSA ST9进行分型研究,发现全部为IVb-t899,这与本研究发现的4株ST9菌株中3株均为ST9-IVb型的结果高度一致性。但这些菌株的spa分型结果却各有不同,推测可能是猪源MRSA在四川地区新的传播亚型。本研究中,spa分型以t1376为主,该类型菌株在数据库(https://www.spaserver.ridom.de/spa-t1376.shtml)中主要以芬兰和荷兰流行为主。中国于2017年首次提交的t1376型别是甲氧西林敏感菌株(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)。本研究中,t1376以MRSA形态出现,说明MSSA-t1376得到了进一步的进化与演变。ST59克隆型是中国地区CA-MRSA的主要流行类型。对于ST59 菌株,已发现至少两种不同的SCCmec类型(IV和V)[46]。本研究也发现CA-MRSA ST59-IV随着猪肉食品链或牲畜相关渠道在进一步传播。成都市生鲜猪肉中分离的MRSA以CA-MRSA和LA-MRSA为主,说明猪肉源MRSA的传播可能存在人与动物之间交叉污染。屠宰及销售环境存在着一定的风险,相关部门应予以重视和加强防范。

金黄色葡萄球菌肠毒素种类具有多样性,迄今发现的葡萄球菌肠毒素血清型有23种[47]。在MRSA肠毒素基因的检测中,有13种肠毒素基因出现了阳性条带,包括sea、seb、seg、sei、sem、sel、seu、sen、seo、seu、sek、seq和selx。58.33%菌株携带三种及以上肠毒素基因。成都市猪源MRSA对肠毒素携带情况不如陕西省猪源MRSA的携带情况严重[45],但MRSA8及MRSA13菌株携带了完整的egc基因簇,是食品安全潜在的危险因素,应当引起重视。

细菌生物被膜的形成给细菌提供了一个稳定的生存环境,从而使其具有更强的抵抗能力,并难以消除[48]。国内外一些相关报道认为,生物被膜阳性菌株的耐药情况相较生物被膜阴性菌株更为严重[49]。本研究中24株MRSA均携带了生物被膜形成相关基因,其中,clfB、eno、icaBC和sasG的检出率均为100%。62.50%的MRSA菌株同时携带耐消毒剂基因和耐药基因,91.67%的菌株表现出多重耐药性。桂中玉等[50]对127株能形成生物被膜的金黄色葡萄球菌(其中MRSA为107株)进行研究,发现菌株耐药率高达90%,本实验的研究结果与之相近。但未来针对MRSA菌株生物被膜形成与菌株携带耐消毒剂基因和耐药基因之间是否有联系还有待深入研究。

综上,本文揭示了成都市猪肉源MRSA菌株的主要流行特征,MRSA菌株在生鲜猪肉中的传播可能会导致严重的动物源食品安全问题,相关部门加强监测和制定相应的防控策略十分必要。