miR-195在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达变化及其过表达对瘤细胞肿瘤生物学特性的影响

盛秀云，张磊，王艳军

聊城市第二人民医院，山东聊城 252600

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）为弥漫性增生的 大B细胞恶性肿瘤，是一种最常见的非霍奇金淋巴瘤，在我国，DLBCL约占非霍奇金淋巴瘤的50%［1］。虽然40%的DLBCL患者经过R-CHOP方案的治疗后能够达到持续缓解，但治疗过程中仍然会有35%～45%的DLBCL患者治疗无效或者效果不理想，DLBCL总体治疗效果仍不能令人满意［2-4］。随着分子生物学研究的飞速发展，越来越多的研究集中于寻找潜在的恶性肿瘤分子靶点来用于新的肿瘤治疗，但至今尚未发现在DLBCL治疗中疗效显著的靶向治疗关键基因靶点。近年来，有关DLBCL的一些分子发病机制已被初步发现［5］。除了编码基因外，还有一些非编码基因，特别是微小RNA（miRNA），被广泛认为是调控DLBCL发生发展最重要的靶点之一［6］。mi R-195属于miR-15、16/195家族重要成员之一，定位17p13.1，在肺癌［7］、结肠癌［8］、食管癌［9］、前列腺癌［10］等许多恶性肿瘤中表达异常，参与肿瘤发生和发展的调控。近期研究发现，miR-195在DLBCL患者肿瘤组织中表达明显降低，并且与患者预后相关［11］，但mi R-195在DLBCL中的作用机制尚不清楚。本研究旨在检测miR-195在DLBCL细胞中的表达及其过表达对瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移等肿瘤生物学特性的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（日本TaKaRa公司）；CCK-8检测试剂盒、RIPA裂解缓冲液（江苏碧云天生物技术研究所）；Lipofectamine2000脂质体转染试剂（美国Invitrogen公司）；miR-195 mimics、NC-mimics（上海吉玛制药公司）；Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；Matrigel胶（美国BD公司）；一抗HMGA2、GAPDH抗体（美国Abcam公司）；HRP标记的二抗（美国Santa Cruz公司）。

1.2 细胞来源及培养 人DLBCL细胞系U2932、HBL1、OCI-LY-10及人正常B淋巴细胞系IM-9购自上海雅吉生物公司，均置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞生长融合度达到70%～80%时进行转染操作。

1.3 细胞转染 取对数生长期的OCI-LY-10细胞，接种于6孔板，按照Lipofectamine2000脂质体转染试剂说明书提供的实验流程，将miR-195模拟物（miR-195 mimics）、模拟物阴性对照（NC-mimics）分别转染至OCI-LY-10细胞，将转染后细胞设为miR-195 mimics组、NC-mimics组。

1.4 细胞中miR-195表达检测 采用实时荧光定量PCR法。按照TRIzol试剂说明书提取U2932、HBL1、OCI-LY-10、IM-9及miR-195 mimics组、NC-mimics组细胞总RNA，分光光度仪检测RNA的浓度及纯度。取总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书操作，将逆转录酶、逆转录引物配置反应体系进行逆转录获得cDNA。取cDNA和PCR引物，按照SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒说明书配制PCR反应体系，反应条件设置如下：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10s，共40个循环。miR-195引物上游序列：5′-GGCTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物上游序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游序列：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-195的相对表达量。

1.5 细胞增殖情况观察 采用CCK-8实验。取miR-195 mimics组、NC-mimics组细胞，以5×104/孔接种于96孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，转染24、48、72、96 h时每孔加入10μL CCK-8溶液，继续避光孵育2 h，酶标仪测定各孔450 nm波长处的光密度（OD）值。

1.6 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。收集转染24 h后的miR-195 mimics组、NC-mimics组细胞，应用1×Annexin V结合缓冲液悬浮，将5μL PI和5μL Annexin V/FITC的混合物添加到细胞中并培养孵育25 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 细胞侵袭和迁移能力观察 采用Transwell小室侵袭及迁移实验。侵袭实验时，Transwell小室置于24孔板内，小室内膜预先均匀涂抹Matrigel胶凝固成膜。取转染24 h后的miR-195 mimics组、NC-mimics组细胞，胰蛋白酶消化，用无血清培养基制成2×104/mL的细胞悬液，Transwell上室每孔加入200μL细胞悬液，Transwell下室则加入500μL培养基（含10%胎牛血清），在37℃、5%CO2的条件下经过24 h培养后取出Transwell小室，擦除上室内膜黏附的细胞，而后甲醛固定细胞，染色，倒置光学显微镜下随机选取6个视野计数穿膜的细胞数。迁移实验时，Transwell小室内膜上不预先涂抹Matrigel胶，之后进行上述同样操作步骤。以穿膜细胞数目表示肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。

1.8 高迁移率族蛋白A2（HMGA2）蛋白检测 采用Western blotting法。收集mi R-195 mimics组、NC-mimics组细胞，加入RIPA裂解缓冲液，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每组取等量蛋白样品，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，后转移至PVDF膜（微孔膜）上，37℃、5%脱脂牛奶里室温封闭1 h，4℃下加入一抗HMGA2和GAPDH抗体，4℃培养过夜，再加入HRP标记的二抗，ECL发光试剂显影，分析条带灰度值。

1.9 统计学方法 使用SPSS22.0统计软件。计量资料用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各细胞中miR-195表达比较 mi R-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10及IM-9中的相对表达量分别为0.51±0.15、0.38±0.10、0.27±0.11、1.02±0.04，与IM-9相比，miR-195在U2932、HBL1、OCI-LY-10中表达降低（P均＜0.05），且在OCI-LY-1中最低。

2.2 两组OCI-LY-10细胞中miR-195表达比较 miR-195 mimics组、NC-mimics组中miR-195的相对表达量分别为8.58±0.40、1.02±0.08，两组比较P＜0.05。

2.3 两组OCI-LY-10细胞增殖活性和凋亡率比较 miR-195 mimics组24、48、72、96 h时细胞增殖活性低于NC-mimics组（P均＜0.05），见表1。miR-195 mimics组、NC-mimics组细胞凋亡率分别为（32.65±4.40）%、（6.41±1.33）%，两组比较P＜0.05。

表1 两组OCI-LY-10细胞增殖活性比较（xˉ±s）

2.4 两组OCI-LY-10细胞侵袭和迁移能力比较 miR-195 mimics组、NC-mimics组侵袭细胞数分别为（81±26）、（206±56）个，迁移细胞数分别为（126±39）、（383±77）个，两组比较P均＜0.05。

2.5 两组OCI-LY-10细胞中HMGA2蛋白表达比较 miR-195 mimics组、NC-mimics组HMGA2蛋白相对表达量分别为0.21±0.09、0.92±0.18，两组比较P＜0.05。

3 讨论

DLBCL是一种具有明显分子和临床异质性的侵袭性疾病。尽管其治疗有了显著进展，但患者预后仍不能令人满意［2］。克服原发性耐药和提高药物疗效是目前DLBCL治疗的挑战。DLBCL的发病机制复杂，涉及不同的遗传和表观遗传变化。目前，基于miRNA的分子靶向治疗成为DLBCL治疗的新策略。DUE等［12］发现，DLBCL中miR-155的高表达与长春新碱敏感性关系密切，并且miR-155高表达与DLBCL患者的临床预后改善有关。SUN等［13］发现，miR-222能够激活DLBCL细胞并促进细胞的增殖和侵袭。miR-23a［14］、miR-101［15］、mi R-26a［16］等许多miRNA被发现与DLBCL细胞的恶性表型有关，但至今尚未发现在DLBCL发生发展、耐药过程中起决定性作用的miRNA。

近年来，众多研究发现miR-195与肿瘤的形成有关，并在细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭中起关键作用［7-10］。然而，miR-195在DLBCL中的作用及其机制尚不清楚。既往研究报道DLBCL患者肿瘤组织中miR-195表达降低［11］，本研究发现DLBCL细胞中miR-195表达也降低，提示miR-195的异常低表达可能与DLBCL的发生发展有关。抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，促进其凋亡是控制肿瘤的有效手段。本研究选择miR-195表达最低的OCI-LY-10细胞作为研究对象，通过转染miR-195mimics提高了细胞中mi R-195的表达，CCK-8实验、流式细胞术和Transwell实验发现，miR-195 mimics组较NC-mimics组细胞增殖活性、侵袭和迁移能力下降，而细胞凋亡率升高，提示上调miR-195能够抑制DLBCL的恶性分子生物学行为。

研究显示，miRNA在机体中发挥的作用与其对下游靶基因的调控有关。在肝细胞癌［17］、食管癌［18］、肺癌［19］中均发现mi R-195能够通过靶向调控HMGA2的表达参与肿瘤的形成发展。HMGA2是目前研究较多的高迁移率族蛋白超家族成员，是在众多恶性肿瘤中异常高表达的关键性转录调控因子，被认为是重要的癌基因［20］。研究证实，HMGA2能够促进DLBCL细胞的增殖、侵袭和迁移［21］。本研究也发现DLBCL细胞中HMGA2蛋白的表达异常升高，上调OCI-LY-10细胞中miR-195表达能够明显抑制细胞中HMGA2蛋白的表达，提示miR-195在DLBCL发生进展中的作用可能与其对HMGA2蛋白的调控有关。

总之，miR-195在DLBCL细胞中呈低表达；上调DLBCL细胞中miR-195的表达可以抑制细胞的增殖、侵袭和迁移，增加细胞的凋亡，其机制可能与miR-195对HMGA2的靶向调控有关。