基于蛋白质组学分析侧脑室微量注射GnIH对下丘脑蛋白的调节作用

王凤霞，司丽娜，魏萌，杨松鹤，程露阳，乔跃兵

承德医学院，河北承德 067000

下丘脑作为调控生殖和能量代谢的高级中枢，其分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）被认为是调节脊椎动物生殖的惟一下丘脑神经肽［1］。2000年，TSUTSUI团队发现了一种可以抑制GnRH释放的新型下丘脑神经肽——促性腺激素抑制激素（GnIH）。GnIH可通过其G蛋白偶联受体GPR147作用于GnRH神经元，抑制促性腺激素合成和释放［2］。本课题组前期实验［3-4］表明，GnIH对GnRH、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、Kisspeptin神经元和阿片—促黑素细胞皮质素原（POMC）起负向调节作用，对神经肽Y（NPY）起促进作用。可见GnIH是调节整个脊椎动物繁殖和神经内分泌系统不可或缺的要素［5］。但GnIH是否会对下丘脑的其他蛋白发挥调节作用有待进一步研究。本研究对卵巢摘除术补充雌激素（OEP）大鼠侧脑室微量注射GnIH，运用液相色谱—串联质谱（LC-MS/MS）和生物信息学分析探讨GnIH对下丘脑蛋白质的影响。另外，经CPTAC数据库检索关键蛋白在激素相关性肿瘤中的表达情况，通过蛋白印迹检测关键蛋白的表达，为探究GnIH与激素依赖性肿瘤的相关性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30只成年SD大鼠，雌性，SPF级，体质量200～250 g，购自北京华阜康实验动物中心（合格证号：11401300016009），饲养于实验动物中心。室温维持在25℃左右，通风良好。SD大鼠循环光照12 h、自由饮水、摄食。本实验所涉及的动物和实验符合实验动物伦理管理委员会的要求。

1.1.2 细胞 将人乳腺癌细胞系MCF-7置于含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中，并置于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养24 h，每2～3 d换液1次，待细胞长满培养皿的80%～90%按1∶2～1∶3进行传代，取对数生长期细胞进行相关实验。

1.1.3 主要试剂与仪器 水合氯醛购于天津博迪化工股份有限公司，苯甲雌二醇购于宁波三生药业有限公司，蛋白酶抑制剂（PMSF）购于北京博凌科为生物科技有限公司，GnIH购自美国Peprotech公司，大鼠脑立体定位仪购自日本Narishige公司，D3024R型台式高速冷冻离心机购自北京大龙公司，Dionex Ultimate 3000 Nano LC system纳升液相色谱系统购于美国戴安公司，DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司，Biological Industries（BI）特级胎牛血清购于以色列生物科技公司，兔单克隆抗体GAPDH、ADPGK分别购于Abcam和Abclon公司，化学发光图像分析系统购自上海天能公司，电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型构建及下丘脑蛋白样本制备 大鼠行双侧卵巢摘除术14 d后，连续5 d皮下注射雌激素0.1 mg/（kg·d），建立OEP大鼠模型。保持大鼠体内雌激素释放水平一致，避免雌激素波动对GnIH的负反馈作用。造模成功后随机分为实验组和对照组，各15例。根据《The Rat Brain in Ttereotaxic Stereotaxic Coordinates》（第三版）的方法进行侧脑室定位：前囟点后1.0 mm，旁开1.5 mm，进针深度4.0 mm，实验组和对照组分别注射GnIH和生理盐水（4μL/只，2μg/μL），每30 s注射0.5μL，于4 min完成注射。给药6 h后取出下丘脑，用PBS清洗并称重。将下丘脑组织放入研磨仪中，加入组织裂解液和PMSF，低温研磨，制成匀浆，于4℃12 000 r/min离心30 min，取上清液，-80℃储存备用。

1.2.2 液相色谱质谱数据分析 将下丘脑蛋白样品酶解，经Dionex Ultimate 3000 Nano LC system纳升液相色谱系统进行LC-MS/MS分析。色谱柱：Thermo Fisher C18；流动相中A：水，0.1%FA，B：乙腈，0.1%FA；色 谱 柱 类 型C18，规 格100 mm×75 mm，孔径300 A，粒径5μm，流速400 nL/min；梯度：0～65 min，B液线性梯度从5%到80%；0～58 min，B液线性梯度从80%到5%；55～65 min，A液保持100%不变。经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行ESI质谱鉴定。分析时长：65 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1800 m/z；一级质谱分辨率：70 000@m/z 200；二级质谱分辨率：17 500@m/z 200；多肽和多肽的碎片质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，得到LC-MS/MS原始数据，用Maxquant-1.5.2.0对肽段进行非标记蛋白质组学定量分析。

1.2.3 差异蛋白的生物信息学分析 本研究对非标记LC-MS/MS质谱分析检测的原始数据，以P＜0.05且差异表达倍数≥2为标准，利用Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多组学在线数据分析平台对差异蛋白进行基因本体（GO）分析和京都蛋白与蛋白组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO分析包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.2.4 蛋白相互作用网络图构建 本实验基于String（https：//string-db.org/）在线数据库检索差异蛋白，构建蛋白—蛋白相互作用（PPI）关系网络，获取蛋白互作数据。将数据上传至Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多组学在线数据分析平台，得到PPI关系网络。

1.2.5 肿瘤中关键蛋白表达鉴定 经生物信息学分析得到的关键蛋白，联合应用UALCAN数据库中CPTAC分析程序，输入关键蛋白名称，CPTAC数据库选择乳腺癌，点击搜索，可显示蛋白在癌组织与癌旁组织的表达情况。

1.2.6 关键蛋白ADPGK表达检测 应用Western blotting法对关键蛋白ADPGK表达进行检测。取MCF-7对数生长期细胞悬液，按GnIH给药浓度（0、1 000、10 000 ng/mL）接种于底面积为21 cm2的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后加药。继续培养24 h，取出各组细胞培养皿，吸弃培养基，用4℃预冷的PBS清洗，加适当体积的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱过夜。冰上裂解30 min，收集细胞悬液，置于4℃低温高速离心机中以12 000 r/mim离心15 min，取上清。根据BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer与上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10 mim，使蛋白变性，冷却至室温-20℃保存。用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白样本（20μg），分离后电流设定200 mA恒流转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。取相应特异性一抗（GAPDH 1∶10 000、ADPGK 1∶2 000）孵育2 h，4℃过夜，复温30 min，TBST洗膜缓冲液洗3次，加入HRP荧光标记的二抗（1∶8 000），室温孵育1 h，洗膜后加入ECL特超敏试剂，经Tanon 6100凝胶成像仪扫描显影。采用Image J软件分析，通过目标蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值来确定目标蛋白的相对表达水平。

1.2.7 统计学方法 所有图表用GraphPad Prism 8制作，实验数据采用GraphPad Prism 8软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD法，方差不齐时两两比较采用DunnettT3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OEP大鼠模型下丘脑组织中差异蛋白鉴定结果 鉴定出253个差异蛋白，其中129个蛋白（A0A0G2JZR4、 A0A0G2K1D2、 A0A0G2K1J5、A0A0G2K1R5、 A0A0G2K272、 A0A0G2K4N7、A0A0G2K508、 A0A0G2K562、 A0A0G2K5Q0、A0A0G2K5Q2、 A0A0G2K6I0、 A0A0G2K774、A0A0G2K7G7、 A0A0G2K7T5、 A0A0G2K8K0、A0A0G2KAL4、A0A0G2KAW7、A0A0G2KAZ2、A0A0H2UHA6、A0A5D0、A1L114、B1WBM0、B1WC61、B2RYG2、B2RYS8、B3SVE9、B5DF03、C9E895、D3Z955、D3ZA84、D3ZAI6、D3ZCA0、D3ZCI5、D3ZCL8、D3ZHI9、D3ZJK8、D3ZQD3、D3ZVR7、D4A1V1、D4A4P3、D4AA52、D4ACX8、E9PSK7、E9PSL7、F1LNG7、F1LP22、F1LP76、F1LRE1、F1LRT9、F1LUE2、F1M471、F1M5C9、F1M5R3、F1M754、F1MAM6、F2Z3T7、F7EMK8、F8V328、F8WFP9、F8WFS9、G3V734、G3V784、G3V7X2、G3V8G6、G3V918、G3V9S0、M0R6K0、M0R6N2、M0RC99、O09178、O35180、O54755、O88954、P01835、P07153、P09034、P09527、P11348、P11505、P11884、P16446、P18163、P20171、P20760、P21816、P23928、P30835、P34926、P41565、P45479、P62632、P62890、P70549、P84586、P85515、Q03555、Q1W1V7、Q499Q4、Q4QR85、Q5BK32、Q5EBD0、Q5M963、Q5M9F7、Q5XIG8、Q5XIT9、Q5XIW9、Q63604、Q66HG4、Q66HM7、Q68FU2、Q68FX9、Q68G11、Q68G16、Q6AY09、Q6AY30、Q6AYU3、Q6IN14、Q6IRK9、Q6NYB7、Q6P7S1、Q6P7S6、Q8CG45、Q99N27、Q9ERC1、Q9R140、Q9WVJ4、R9TL61）上调，124个蛋白（A0A0G2JW58、A0A0G2JW 92、A0A096MJD3、A0A0G2JTG7、A0A0G2JW88、A0A0G2JXC3、 A0A0G2JYW3、 A0A0G2JZM2、A0A0G2K079、 A0A0G2K1A5、 A0A0G2K327、A0A0G2K3P4、 A0A0G2K5C6、 A0A0G2K5E6、A0A0G2K6J5、 A0A0G2K7Y2、 A0A0G2K8I0、A0A0G2K8K9、 A0A0G2K930、 A0A0H2UI35、A0JN17、A1A5L2、A1L1M0、A8WCF8、B0BN18、B2RYJ7、B2RZ79、B3GS92、B3VQJ0、B5DFE0、B6DTP5、D3Z8H0、D3ZGQ3、D3ZIL6、D3ZLH9、D3ZLT1、D3ZRI1、D3ZSL2、D3ZTW9、D3ZUP5、D3ZXF9、D3ZZK3、D3ZZQ0、D4A3B0、D4A4D5、D4A8B3、D4AAF8、D4AE96、E9PSV5、F1LN88、F1LP21、F1LRW6、F1LUV9、F1LX47、F1M7Y3、F7ES73、F7ESM5、F7FKI5、F8WFH8、F8WFM2、G3V6L9、G3V6P7、G3V6S2、G3V803、G3V984、G3V9G3、G3V9Z6、I6L9G6、M0R7Q5、M0R9X8、M0RCV0、O35509、O70419、P04218、P07171、P10362、P11275、P13383、P13852、P20651、P35332、P36201、P51583、P59649、P60522、P62630、P62963、P68403、P97532、Q05140、Q1RP74、Q4KLJ1、Q4KM71、Q4V8E2、Q4V8I7、Q5BJU0、Q5HZV9、Q5RJL0、Q5U1Z9、Q5XI72、Q5XIJ3、Q62861、Q63092、Q63798、Q64538、Q66HM2、Q6DGF2、Q6DUV1、Q6P685、Q6P783、Q6P7A7、Q6S399、Q6XVN8、Q7TQ77、Q7TSD7、Q80W98、Q80Z30、Q810D0、Q920Q0、Q9ERD1、Q9JKT0、Q9QUH6、Q9QXY2、R9PXS4、R9PXU4、R9PXW7）下调。

2.2 OEP大鼠模型下丘脑组织中差异蛋白的GO功能富集分析 BP有540个条目显著富集（P＜0.05），CC有174个条目（P＜0.05），MF有184个条目（P＜0.05），见表1。

2.3 OEP大鼠模型的下丘脑差异蛋白的KEGG通路富集分析 KEGG通路富集与本研究关系较密切的是代谢途径、糖酵解/糖原异生、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、半乳糖代谢等10条主要通路（表2）。

2.4 下丘脑PPI网络 有51个节点蛋白和92条蛋白相互作用关系，代谢途径中有NDUFB8、NDUFB7、OGDHL、FAM213B、NDUFB3、ALDH2、ADPGK、GART、AMPD3、RPN1、ASS1、QDPR、ACSL1、CDO1、PFKL、PPT1、PAICS、MPST、PGM1、CMAS、MCCC2、GALM、ASAH1；糖酵解/糖异生中有ALDH2、ADPGK、PFKL、PGM1、GALM；内分泌和其他因子调节的钙重吸收中有PRKACA、CALB1、ATP2B1、AP2A2；半乳糖代谢中有PFKL、PGM1、GALM；军团菌病中有EEF1A1、EEF1A2、RAB1A；长 时 程 增 强 中 有PRKACA、CAMK2A、HRAS；寿命调解途径—多物种中有PRKACA、HRAS、CRYAB；戊糖磷酸途径中有PFKL、PGM1；亨 廷 顿 病 中 有NDUFB8、NDUFB7、IFT57、NDUFB3、AP2A2；朊病毒病中有PRKACA、PRNP。综合分析GO、KEGG和PPI显示，差异蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2同时富集于代谢途径和糖酵解途径，其中GALM、ADPGK、PGM1、PFKL为上调蛋白，ALDH2为下调蛋白。

2.5 CPTAC数据库中关键蛋白在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达比较 节点蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2在乳腺癌组织中的表达高于正常乳腺组织，PGM1（P=0.250 0）蛋白表达高低与乳腺癌患者总体生存期无关，GALM（P=0.050 0）、ADPGK（P=0.006 0）、PFKL（P=0.006 2）和ALDH2（P=0.009 2）的高表达与患者总体生存期有关。

表1 下丘脑组织中差异蛋白的GO功能富集分析

表2 KEGG富集的10条主要信号通路

2.6 GnIH对乳腺癌细胞系MCF-7中ADPGK表达的影响 0、1 000、10 000 ng/mL GnIH作用MCF-7细胞中ADPGK蛋白相对表达量分别为1.08±0.02、1.17±0.06和1.29±0.16，0与10 000 ng/mL浓度比较P＜0.05。

3 讨论

哺乳动物以下丘脑—垂体—性腺轴为主导，通过神经内分泌系统相互协调且规律地进行着繁殖生理活动［6］。GnIH作为下丘脑—垂体—性腺轴中的重要负向调控因子，对生殖神经内分泌系统发挥重要的调控作用。

本研究对OEP大鼠行侧脑室微量注射GnIH，取下丘脑制备蛋白匀浆，基于非标记定量的蛋白质组学，共筛选出差异蛋白253个，其中129个蛋白显著上调，124个蛋白显著下调。GO结果显示，差异蛋白在细胞质和细胞核有富集，参与单体和小分子代谢过程，并且主要与小分子相互作用，可以和细胞内特异性转运系统作用对体内各种生理功能产生影响。KEGG结果表明，参与肿瘤发生发展的信号通路糖酵解途径在下丘脑差异蛋白中呈现显著差异性。综合考虑蛋白的差异变化程度以及蛋白间相互作用的情况，从PPI蛋白互作网络筛选出GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL为关键节点蛋白，且其共同参与肿瘤相关的糖酵解途径。

糖酵解途径作为代谢途径之一，与肿瘤［7］、生殖［8］和神经内分泌系统［9］有关，并为机体提供生命活动所需能量。在激素依赖性乳腺癌的研究中发现，癌细胞的葡萄糖摄取通过激活糖酵解表型而增加癌基因Akt的表达，Akt激酶活性的增加大多与预后不良有关［10］。结合本实验的差异蛋白富集糖酵解通路结果，推测GnIH可能通过糖酵解途径影响激素依赖性相关生殖神经内分泌系统疾病。在生物体中，蛋白质并不是独立存在的，其功能的行使必须借助于蛋白质间的相互作用来调节和介导［11］。磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途径中最关键的限速酶，且PFK分为PFKM、PFKL和PFKP三种亚型，PFKL是筛选出的节点蛋白。研究表明，PFKL过表达导致葡萄糖摄取增加和乳酸的产生，促进糖酵解［12］。另有研究发现，抑制PFKL的表达会抑制细胞增殖和致瘤性，如在雌激素相关的乳腺癌中发现雌激素通过激活PI3K-Akt途径刺激糖酵解，诱导PFKL表达增加，促进乳腺癌的发生［13-14］。ALDH2作为一种乙醇代谢重要的酶，处于糖酵解/糖异生信号通路的核心位置［15-16］。ALDH2活性的降低和由此产生的较高浓度的乙醛可能是乙醇诱发癌症的危险因素［17］。研究发现，在饮酒诱发的卵巢癌［18］和乳腺癌［19］中，ALDH2表达下调，导致乙醛暴露增加，从而促进癌症的发生发展。除了对肿瘤产生影响外，在神经内分泌系统也发挥着作用。研究显示，ALDH2表达增高可促进瘦素［20］和促黑素细胞皮质素原［21］表达增高。PGM1是糖酵解途径中的关键酶，通过催化1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的相互转化维持葡萄糖稳态［22］。研究发现，组织细胞发生癌变时需要摄取大量葡萄糖，PGM1在激素依赖性子宫内膜癌组织中高表达，PGM1为肿瘤细胞持续生长提供能量［23-24］。此外，在人类卵巢巨噬细胞中发现，PGM1表达增多可促进黄体退化，说明PGM1与雌孕激素的分泌和释放密切相关［25］。ADPGK利用ADP作为磷酸供体催化葡萄糖非阳离子磷酸化为葡萄糖6-磷酸［26］，参与糖酵解途径对能量代谢起关键作用。研究发现，在激素依赖性肿瘤的前列腺癌和乳腺癌中ADPGK高表达，ADPGK高表达可以驱动糖酵解使葡萄糖摄取增加，促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭［27-29］。GALM是参与半乳糖调节的重要相关酶。研究发现，GALM对人癌细胞生长有较强的抑制作用，且呈剂量依赖性，其机制可能与Caspase-12的表达增加有关［30］。

乳腺癌属于激素依赖性肿瘤，雌激素与乳腺癌的发生发展密切相关。本实验选用雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7细胞系验证，经GnIH作用后下丘脑关键蛋白ADPGK与MCF-7细胞系的ADPGK蛋白表达及功能行使是否一致，探索GnIH与激素依赖性肿瘤之间的关系。研究显示，ADPGK可催化葡萄糖-6-磷酸的生成，葡萄糖-6-磷酸是所有生命代谢的中心反应［26］。在组织水平，侧脑室微量注射GnIH后蛋白质组学和生物信息学分析显示下丘脑差异蛋白ADPGK表达上调，促进糖酵解使下丘脑获得足够的能量并加速代谢。另有研究表明，ADPGK在肿瘤细胞中表现出促生存和抗凋亡作用［31］。在细胞水平，GnIH给药后经蛋白免疫印迹验证MCF-7细胞中ADPGK蛋白相对表达水平下降，与其他研究者结果一致。从以上结果可推测，在正常组织中GnIH可能通过糖酵解途径上调下丘脑蛋白ADPGK促进代谢，而在肿瘤细胞中GnIH可发挥抑制ADPGK蛋白的表达达到促进MCF-7细胞凋亡的作用。

综上可见，GnIH通过参与葡萄糖摄取的糖酵解途径，影响GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2的表达，之后经过一系列神经内分泌反馈调节促性腺激素合成和释放以支持生物体活动，这可为神经内分泌系统疾病的激素依赖性肿瘤的诊断与治疗提供更多的策略。