失眠患者血清钙调蛋白及GABA/Glu水平检测及其意义

苏 婷，高 威，李华欣，袁 梅

失眠的定义是指有足够的时间和睡眠环境适宜的情况下，对睡眠效果不满意的主观体验，表现为难以入睡、睡眠维持障碍、早醒、睡眠质量下降和总睡眠时间减少，是一种最常见的睡眠障碍[1，2]。2006 年中国睡眠研究会进行了一项研究，范围涉及6个城市，其结果表明，中国内地成人失眠的平均发生率为 57%(44%～68%)[3]。2008年一项国际综合调查研究发现睡眠问题的患病率在美国为56%，在西欧为31%，在日本为23%[4]。失眠对患者的身心健康和生活质量造成严重影响，因失眠产生的疲劳、精神不集中是造成交通事故和安全生产事故的主要原因之一，对个人和社会都造成严重的损失[5]。

但目前失眠的发病机制尚不明确。多个研究结果表明，多种神经递质如谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等参与了中枢对睡眠的调节且发挥了相当关键的作用[6～8]。神经递质主要是由神经元突触以囊泡胞吐形式释放到突触间隙实现信号转导，该过程是由钙离子(calcium，Ca2+)流信号触发。Ca2+在细胞外信号转导和神经元功能控制中发挥关键作用。它参与控制神经细胞膜的兴奋性、神经分泌、突触可塑性、基因表达和程序性细胞死亡。而钙离子的生理功能主要通过钙调蛋白(calmodulin，CaM)来实现。CaM调节突触蛋白磷酸化，并在调节神经递质释放中发挥作用。这些研究表明，CaM可能在神经递质GABA、Glu的调控中起到重要作用。然而，异常表达的CaM是否通过影响GABA及Glu水平参与失眠的发病目前尚无报道。本文通过检测血清CaM及GABA/Glu 在失眠患者血清中的水平及其相关性，探讨其与失眠发病的相关性。

1 对象和方法

1.1 一般资料 本研究失眠组为2017 年1月至 2019 年4月南华大学附属第二医院睡眠中心就诊的符合入选标准的失眠患者，共119例，其中男51例，女68例，平均年龄(51.65±11.73) 岁。健康对照组为南华大学附属第二医院健康体检者，随机选取102例，其中男45例，女57例)，平均年龄(51.53±13.12) 岁。

1.2 诊断与纳入、排除标准 纳入标准：(1)年龄≥18周岁；(2)所有失眠组的患者均符合睡眠障碍国际分类第三版失眠的诊断标准；(3)失眠组的患者失眠病程≥3 m。所有研究者有以下任意情况之一者均排除在本研究之外：(1)脑血管病；(2)多导睡眠图(PSG)监测排除合并有睡眠呼吸暂停综合征、不宁腿综合征、快速动眼运动睡眠期行为异常(RBD)等其他睡眠障碍性疾病；(3)有严重的心肺肝肾功能障碍患者；(4)严重的内分泌疾病、自身免疫性疾病、癌症、感染性疾病、传染性疾病、血液系统疾病病史；(5)近期有外伤手术史、妊娠史；(6)HAMA焦虑量表评分>14分，HAMA抑郁量表评分≥18分。本研究经本院医学伦理委员会批准(伦理编号2016-01-0001)，所有研究对象或家属均签署知情同意书。

1.3 研究方法 血浆CaM、GABA、Glu水平测定：抽取失眠组及对照组静脉血约3 ml，室温放置2 h或4 ℃过夜后于3000 r/min，离心20 min，收集血清 0.5 ml，-20 ℃ 冰箱保存备用。CaM水平采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法，使用奥地利tacan GmbH 5082全自动酶标仪测定。人CaM-ELISA试剂盒购自苏州卡尔文生物科技有限公司。GABA和Glu的测定采用双抗体夹心法测定。Glu和GABA标准品由美国Sigma公司提供。检测过程严格按照试剂盒的说明操作。

2 结 果

2.1 失眠组和对照组患者一般资料和血清 CaM 、GABA、Glu水平的比较 (1)失眠组中性别、年龄和对照组比较(P>0.05)，无统计学差异；(2)失眠组患者与对健康照组相比，血清CaM、GABA、GABA/Glu水平降低，Glu水平升高，有统计学意义(P<0.05)(见表 1)。

表1 失眠组和对照组患者一般资料和血清生化指标的比较

2.2 失眠组患者血清CaM水平与GABA/Glu水平的关系 进一步通过 pearson相关分析发现，失眠患者血清 CaM 水平与GABA/Glu水平呈正相关(r=0.475，P<0.01)(见图1)。

图1 血清CaM水平与GABA/Glu水平的关系

3 讨 论

本研究发现失眠患者血清CaM水平降低、GBAB水平下降，Glu 水平升高，GABA/Glu水平下降，且血清CaM水平与GABA/Glu水平呈正相关，对失眠发病机制的研究具有重要意义。

脑内兴奋性和抑制性氨基酸神经递质的水平失衡是失眠的重要病因，据研究，人的大脑中有一百多种脑神经质，其中与失眠有直接关系的主要有GABA、Glu等，这些物质是参与睡眠觉醒周期调节的过程中最主要神经递质。GABA是一种广泛存在于中枢神经系统中的抑制性神经递质[9]；在谷氨酸脱羧酶的催化下由兴奋性神经递质谷氨酸通过脱羧反应而产生，并与突触后膜的 GABA 受体结合，导致离子通道打开，使带负电的氯离子流入细胞，带正电的钾离子流出细胞，通过突触后神经元放电速率减慢来抑制中枢神经元[10]。Watson等[11]研究结果显示，大鼠快速动眼睡眠减少、觉醒增加与脑桥网状结构中GABA水平的下降有关。GABA在大脑组织中的含量与睡眠-觉醒的深度呈正相关[12，13]。发表在Sleep 杂志上的研究发现，与对照组相比，原发性失眠患者的平均脑GABA水平降低了近30%。

Glu是脑中含量最高的游离氨基酸，主要分布于海马、大脑皮质、纹状体和小脑，是脑组织中重要的兴奋性氨基酸类递质[14]。Glu对中枢神经系统的神经元可以起到兴奋作用，如果Glu的释放过量，就会产生兴奋性神经毒性，从而诱发失眠。一项关于分析内因性失眠症的研究显示失眠患者GABA 水平明显降低，而 Glu水平明显升高[15]。这与我们的研究结果一致。

脑内兴奋性神经递质Glu与抑制性神经递质GABA循环代谢保持相对平衡状态，两者的比值 GABA/Glu常用作评估中枢神经系统兴奋和抑制状态。既往研究结果表明，脑内Glu和GABA含量及其受体功能的改变在睡眠的调节中发挥着重要的作用，参与睡眠-觉醒过程及不同睡眠时相的转换[16]。目前直接测定失眠患者脑内Glu和GABA水平较困难，但既往研究显示可以通过测定Glu和GABA在血浆中的水平间接反映其在脑内的水平[6，7]。有研究表示Glu/GABA的比值可以作为判断失眠的客观指标[17]。本研究结果显示，失眠患者血清GBAB/Glu水平低于健康对照组。这表明失眠患者存在血清GBAB、Glu比例失衡。

CaM 是一种高度保守的酸性蛋白质，广泛存在于各种真核生物细胞，它由 148 个氨基酸组成单条多肽，CaM能与Ca2+结合。Ca2+被称为细胞内的第二信使，其浓度变化可调节细胞的功能，调节各种细胞事件(包括运动性，胞吐作用，细胞骨架组装，肌肉收缩等)，这种调节主要通过钙调蛋白来实现。

钙调蛋白以高浓度(最高约100 μmol/L)存在于大脑中。Ca2+/CaM信号通路在许多神经系统疾病的病理生理过程中发挥着重要的作用。在脑内，钙调蛋白功能被认为可能与包括癫痫，卒中、记忆力减退和智力障碍等神经系统疾病的病理状况有关。Wen 等运用外伤性大鼠模型研究发现外伤性后前额内侧皮质Ca2+浓度增高，可激活CaM信号转导通路，导致认知功能失调[18]。急性缺血性脑卒中患者血清 CaM 水平明显增高，可作为判定脑梗死病情严重程度的重要指标[19]。CaMKIIγ是一种参与长期可塑性，学习和记忆的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，它是钙调蛋白的主要靶点。有研究显示，CaMKIIγ(R292P)中的点突变会干扰钙调蛋白向细胞核的穿梭，从而破坏空间学习，记忆并导致智力障碍[20]。在另一项研究中，Kv7钾离子通道的突变可以降低钙调蛋白的结合，从而破坏到质膜的通道运输。因此，神经元的兴奋性和放电频率会受到影响，导致从轻度癫痫到早发性脑病的病理状态[21]。此外，已通过实验证实钙调蛋白在阿尔茨海默病的传导过程中的关键作用，并表明干扰钙调蛋白结合或突变的功能可导致严重的神经病理淀粉样β斑块形成[22]。这些研究结果共同证明了钙调蛋白在神经系统的调控中有重要作用。

然而，CaM是否与失眠的发病有关目前尚无报道。既往的研究和及我们的研究均表明，失眠与Glu、GABA等神经递质有关[9][14]。其中，Glu是海马区主要的兴奋性神经递质，它的释放是对突触前神经元膜去极化的反应，并激活突触后Glu受体。Glu受体的激活打开了连接到受体的离子通道，允许细胞外的钙进入细胞内的细胞质，触发了一系列的生化事件。Glu、GABA等神经递质主要是由神经元突触以囊泡胞吐形式释放到突触间隙实现信号转导，该过程是由Ca2+流信号触发。Ca2+信号经不同的钙离子感受器蛋白将胞内Ca2+浓度变化的信号传递给多种依赖Ca2+信号而发挥生物学功能，最终调控不同功能。而钙离子生理功能的发挥主要是由CaM来调节。在神经细胞中，CaM通过与多种相关蛋白的相互作用调控神经细胞胞吞、胞吐、递质释放作用方面受到广泛的关注。研究发现，钙调素拮抗剂，三氟拉嗪(TFP) 抑制了GABA的释放，在去极化过程中，由细胞内钠水平升高和钙进入神经末梢所引起的递质释放可能是由钙调蛋白依赖过程介导的[23]。有证据表明，CaM调节突触蛋白磷酸化，并在GABA、Glu等调节神经递质释放中发挥作用。有报道发现JuA，一种非竞争性的CaM抑制剂，对小鼠活性有抑制作用[24]。JuA对谷氨酸介导的海马兴奋性信号通路具有抑制作用[25]，可能是通过其抗CaM发挥作用[26]。我们的研究发现钙调蛋白与GABA/Glu水平呈正相关。推测钙调蛋白可能通过调控GABA、Glu等神经递质释放，影响GABA/Glu比值，而参与失眠的发病。CaM 在失眠发病的具体机制研究还需要进一步通过钙调蛋白拮抗剂的动物实验等来验证。钙调蛋白有望成为预测和治疗失眠的一项新方法，对降低失眠的发生率及改善睡眠具有重要的意义。